论文摘要
第一部分肺上皮干/祖细胞的筛选和鉴定目的分离、筛选和鉴定肺上皮干/祖细胞,分析其与肺上皮修复反应的关系。方法首先从小鼠肺组织中获取单个肺细胞悬液,通过流式细胞术检测CD45-/CD31-/Sca-1+（Stem Cell Antigen-1）细胞在正常小鼠肺内的表达水平及其细胞周期,并采用流式细胞分选术从肺单细胞悬液中筛选出该细胞群,使用免疫荧光染色对其具体细胞成分进行鉴别,体外培养评估其增殖能力,最后通过病毒病原相关分子模式（Pathogen-Associated Moleuclar Patterns,PAMP）感染模型明确该细胞群与肺上皮修复反应的关系。结果正常小鼠肺内有低水平的CD45-/CD31-/Sca-1+细胞表达。与CD45-/CD31-/Sca-1+细胞相比,CD45-/CD31-/Sca-1+细胞主要处于DNA合成期或合成后期/分裂期,且在体外培养过程中仅CD45-/CD31-/Sca-1+细胞分裂增殖形成细胞集落；细胞免疫荧光染色显示CD45-/CD31-/Sca-1+细胞主要由细支气管肺泡干细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞和Clara细胞组成。这些体外实验结果表明具有增殖能力的CD45-/CD31-/Sca-1+细胞是一个异质干/祖细胞群。之后体内实验的结果发现在病毒双链RNA（dsRNA）模拟物Poly（I:C）诱导肺上皮细胞凋亡的同时,肺CD45-/CD31-/Sca-1+细胞的表达水平出现上升,并随着凋亡程度的加重而逐渐升高；且在此过程中,CD45-/CD31-.Sca-1+细胞表达水平的变化与肺上皮Ki67阳性细胞所呈现的动力学十分相似。由此可知Poly（I:C）刺激同时触发了肺上皮的损伤和修复反应,且肺CD45-/CD31-/Sca-1+细胞参与了肺上皮的再生修复过程。结论肺CD45-/CD31-/Sca-1+细胞是具有部分祖细胞特性的异质干/祖细胞群,该细胞群的表达水平代表了Poly（I:C）刺激下肺上皮组织的再生修复反应。第二部分香烟烟雾和病毒PAMP联合诱导的COPD小鼠模型中肺上皮干/祖细胞表达和损伤/修复失衡目的观察COPD （Chronic Obstructive Pulmonary Disease）肺组织中上皮干/祖细胞的表达及不同解剖区域上皮的损伤/修复反应。方法：通过香烟烟雾（Cigarette Smoke, CS）和病毒PAMP模拟物Poly（I:C）联合暴露建立肺损伤模型,检测该模型肺组织中气道和肺泡的病理改变,采用流式细胞术检测肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖细胞群在COPD肺组织中的表达水平,通过TUNEL和Ki67等免疫荧光染色分别观察气道和肺泡上皮细胞的凋亡和增殖情况。结果香烟烟雾和Poly（I:C）联合暴露的小鼠肺组织中出现显著气道壁增厚和肺泡结构破坏,是成功模拟了气道纤维化重建和肺泡稀薄化的COPD模型；在该COPD模型中,肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖细胞表达上调,但与Poly（I:C）组比较其表达水平明显下降,表明香烟烟雾抑制了Poly（I:C）诱导的肺上皮干/祖细胞扩增；TUNEL染色和免疫荧光染色显示模型中气道上皮细胞以增殖反应为主,而肺泡上皮细胞以凋亡反应为主。结论香烟烟雾和病毒PAMP模拟物Poly（I:C）联合暴露诱导的小鼠肺损伤模型是同时模拟了COPD小气道纤维化重建和肺泡稀薄化的COPD模型；香烟烟雾抑制了Poly（I:C）诱导的肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖细胞扩增,提示香烟烟雾和Poly（I:C）联合暴露刺激通过影响肺上皮干/祖细胞的表达导致异常的肺上皮修复反应；在该COPD模型中气道和肺泡上皮呈现相反的上皮细胞损伤/修复失衡：气道上皮以增殖反应为主,而肺泡上皮则以凋亡反应为主,与观察到的气道纤维化重建和肺泡稀薄化改变一致,提示肺上皮损伤/修复失衡参与COPD肺组织重建。第三部分抗病毒先天性免疫对COPD中肺上皮干/祖细胞和损伤/修复反应的影响目的检测抗病毒先天性免疫TLR3（Toll-Like Receptor 3）和RLH-MAVS（RIG-Like Helicases-Mitochondrial Antiviral Signaling Protein）信号通路对COPD肺组织中上皮干/祖细胞表达和不同解剖区域上皮损伤/修复反应的影响。方法使用野生型（Wild Type,WT）、TLR3基因敲除（TLR3-/-）及MAVS基因敲除（MAVS-/-）小鼠重复香烟烟雾和Poly（I:C）联合暴露诱导的COPD模型,检测各型小鼠肺组织中气道和肺泡的病理改变,流式细胞术检测CD45-/CD31-/Sca-1+肺上皮干/祖细胞的表达水平,并通过TUNEL和Ki67等免疫荧光染色分别观察气道和肺泡上皮细胞的凋亡和增殖情况。结果香烟烟雾和Poly（I:C）联合暴露后,TLR3-/-和MAVS-/-小鼠肺组织中炎性细胞浸润程度和CD45-/CD31-/Sca-1+细胞表达均较WT小鼠明显下降,敲除MAVS基因同时逆转了气道纤维化重建和肺泡稀薄化,而敲除TLR3基因仅改善了气道增生和纤维化。TUNEL和免疫荧光染色的结果显示TLR3和MAVS表达缺失均同时抑制了肺上皮细胞的凋亡和增殖反应,但在CS+P暴露的TLR3-/-小鼠肺组织中,气道上皮细胞凋亡/增殖水平几乎持平,肺泡上皮中增殖细胞比例明显低于凋亡细胞比例；而CS+P暴露的MAVS-/-小鼠气道和肺泡上皮细胞凋亡/增殖水平均接近同一水平,说明敲除MAVS基因能够同时逆转CS+P诱导的气道上皮过度修复和肺泡上皮的修复不足,而TLR3基因缺失仅抑制了气道上皮的过度修复。结论在香烟烟雾和Poly（I:C）诱导的COPD模型中,TLR3和RLH-MAVS信号通路参与和促进了肺组织炎症,并通过调控肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖细胞表达以及上皮细胞凋亡和增殖反应介导肺组织重建,其中,气道上皮呈现修复过度的损伤/修复失衡主要受到TLR3信号通路的调控,而肺泡上皮表现为修复不足的损伤/修复失衡主要受到RLH-MAVS信号通路的调控。
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