论文摘要
基本节律性呼吸是维持哺乳动物生命活动的基本条件,基本呼吸节律产生的部位位于低位脑干的延髓。但迄今基本节律性呼吸发生及其调控机制仍未清楚;临床日常用药如运用吗啡类药物镇痛时会引起呼吸功能的异常;另一方面在临床工作中很多疾病如各种中枢性呼吸衰竭、中枢性呼吸节律紊乱等很常见,也是引起病人死亡的常见原因之一。因此阐明呼吸节律发生的确切部位揭示其发生与调控机制无疑是神经科学领域重要课题之一;研究呼吸节律阐明基本生命现象的本质不仅在理论上有着重要的意义,而且对于指导临床工作也具有重要的应用价值。为更好地研究呼吸节律,前人建立了新生大鼠离体延髓-脊髓标本模型、延髓脑片标本、pre-B（o|¨）tC“岛”,它们是研究呼吸节律的产生和调节机制良好的体外标本。正是借助这些标本,国内外的学者对呼吸中枢的确切发生部位又做了大量的研究工作。目前主要有以下几种观点:1.延髓面神经后核内侧区（the medialarea of nucleus retrofacialis,mNRF）1986年我室吴中海等提出mNRF是节律性呼吸产生的部位。mNRF包括面神经后核内侧、网状小细胞核腹外侧、网状巨细胞核背外侧和外侧网状核内侧部分。2.pre-B（o|¨）tzinger复合体（pre-B（o|¨）tzingercomplex,pre-B（o|¨）tC）1991年Smith等人的实验表明,在延髓吻端的一个部位对呼吸节律的发生极为重要,这个部位称为pre-B（o|¨）tC;在该Pre-B（o|¨）tzinger复合体内存在着一类电压依赖性的、能够产生节律性发放活动的神经元,称之为起步神经元（Pace-maker neurons）;它对于产生节律性的呼吸活动可能具有重要的意义。3.延髓头腹外侧区（the rostral ventrolateral medulla,RVLM）Onimaru等学者认为可能RVLM是产生基本呼吸节律的关键部位。4.面神经核周围区（thevicinities of nucleus facialis,VFN）VFN包括面神经后核、斜方体后核、pre-B（o|¨）tC。这四种定位的区域全部位于延髓头腹外侧区,相互之间不完全相同,但有重叠。对于呼吸节律产生机制的认识上目前主要存在两种学说,即起步细胞学说（pacemaker neuron hypothesis）、神经网络学说（neurons network hypothesis）起步细胞学说认为在延髓存在具有“起步”性质的呼吸神经元,它们表现有内在的节律性活动,这种活动影响和决定了其它呼吸相关神经元的活动。我室在整体及新生鼠离体延髓脑薄片标本的mNRF记录到具有“起步”特征的呼气-吸气跨时相神经元（Expiratory-Inspiratory phase spanning neuron,E-I PS）,这类神经元放电开始于吸气前（呼气相的中、晚期）,以频率递增的形式发放至吸气开始,然后以恒频的形式持续,最后与吸气性放电同步结束。这类放电总是先于吸气放电的神经元可能就是“起步神经元”（Pacemaker neuron）。神经网络学说是以Richter等为代表,该学说认为由呼吸节律发生器（RRG）和吸气形式发生器（IPG）组成呼吸神经元网络,呼吸节律的产生依赖于延髓内呼吸神经元之间复杂的相互联系和相互作用。诸多的神经递质、调质控制呼吸网络的活动。多巴胺（dopamine,DA）是一种小分子神经递质,属于儿茶酚胺类。在纹状体、延髓、大脑皮层等部位有大量的多巴胺受体分布。多巴胺参与呼吸活动、药物成瘾、痛觉以及缺血再灌注损伤等的调节。依据细胞内信号转导过程的差异和氨基酸序列的差异,DA受体可以分为多巴胺D1、D2、D3、D4、D5五种受体,它们都是G-蛋白耦联受体。D1、D5受体通过Gs蛋白与腺苷酸环化酶（adenylate cyclase,AC）正偶联,使AC的活力增加,使细胞内的cAMP水平升高,进而磷酸化效应蛋白,产生各种生理病理效应;多巴胺D2、D3、D4与Gi蛋白与AC负相关,从而抑制AC的活力,降低cAMP水平,以及提高磷脂酰肌醇代谢等,产生一系列的生理学效应。多巴胺作为一种神经递质,参与呼吸的调节。在体研究表明,静脉途径给予多巴胺D1受体激动剂,可以增强膈神经和吸气神经元的放电活动;多巴胺D1受体阻断剂能够抑制膈神经放电、增强呼气神经元的兴奋性;多巴胺D1受体激动剂可以阻逆阿片类物质所引起的呼吸抑制,而不影响阿片类物质的镇痛效果,这些在体的研究结果提示多巴胺D1受体可能与呼吸的调节有关。大量的研究表明激活或抑制多巴胺及其D1受体会影响cAMP的水平。ChengL等人在负鼠肾细胞的研究表明激活的多巴胺D1受体可激活细胞内腺苷酸环化酶使cAMP出现剂量依赖性的增加,并且在磷酸二酯酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤存在的条件下,还会引起cAMP的显著增加;且这种作用可被D1受体阻断剂阻断。利用逆转录聚合酶链反应技术Smith DO等发现小鸡胚胎脊髓运动神经元表达多巴胺D1受体,将神经元用100 microM多巴胺抚育后,神经元内的cAMP水平将会增加33%。对家兔动脉血中cAMP含量进行测试的结果表明,多巴胺D1受体激动剂非诺多巴可以引起。肾、肺脏、肠系膜、股动脉cAMP出现剂量依赖性增加,多巴胺D1受体特异性拮抗剂SCH-23390可以显著地阻断这种效应。cAMP作为一种第二信使,在细胞信号转导中起着重要的作用。研究表明cAMP在中枢呼吸节律产生的调节中同样起着重要的作用:在离体延髓脑片上clonidine通过α2-肾上腺素能受体降低细胞内cAMP的水平,从而抑制C4和前吸气神经元的放电活动;甲基黄嘌呤、Db-cAMP与forskolin有相似的作用,都可以增加前吸气神经元的发放频率;cAMP可以通过调节前吸气神经元的内在发放特性来调控呼吸节律的产生。激活AC、增加细胞内cAMP的水平或者是激活多巴胺D1受体可以逆转阿片和PGE1所引起呼吸抑制。2003年Shao在离体延髓脑片研究了AMPA受体对吸气神经元放电活动的调节机制后指出,提高细胞内cAMP水平或者用蛋白激酶A抑制剂Rp-cAMPS阻断呼吸细胞内cAMP的作用可影响呼吸细胞节律性放电活动,cAMP-PKA信号转导途径可调控pre-B（o|¨）tC区吸气神经元的兴奋性,且内源性PKA的水平是影响静息呼吸频率的一个重要因素。在离体脑片上多巴胺D1受体对呼吸基本节律性发生和调节有什么样的作用,通过什么样的途径起作用的,这些问题还不是很清楚,为了解决这些问题设计了本课题。旨在利用包含舌下神经根和mNRF的离体延髓脑薄片:①探讨多巴胺D1受体对舌下神经根呼吸节律性放电活动的影响;②观察多巴胺D1对舌下神经根及吸气神经元/双相呼气神经元放电活动的调制作用;③研究cAMP变化对呼吸神经元基本放电活动的影响。④观察pre-B（o|¨）C“岛”多巴胺D1受体的表达情况;⑤探讨多巴胺D1受体调控基本呼吸节律的可能机制。1、多巴胺D1受体对舌下神经根呼吸节律性放电活动（the respiratoryrhythmic discharge activity,RRDA）的影响1.1不同浓度A68930组对RRDA影响用不同浓度A68930灌流脑片后,呼吸周期（respiratory cycle,RC）和呼气时间（expiratory time,TE）随浓度的增加逐渐缩短、放电积分幅度（integral amplitude,IA）逐渐增大;不同浓度组间RRDA的RC比较总体上有差别（F=48.663,P＜0.001）,TE总体上有差别（F=53.655,P＜0.001）,IA总体上有差别（F=7.760,P=0.002）。其中5μmol/L组的作用效果最明显;5μmol/L组3 min三相指标RC、TE、IA与5 min时的三项相应指标比较没有统计学差异,P值分别为0.797、0.809、0.226,即3-5分钟可以取得药物的稳定作用,选择5μmol/L作为实验的合适浓度。1.2不同浓度SCH-23390组对RRDA影响给予浓度SCH-23390灌流脑片后,RC（F=70.561,P＜0.001）和TE（F=79.659,P=0.000）随浓度的增加逐渐延长、吸气时间（inspiratory time,TI）（F=21.800,P＜0.001）逐渐缩短、IA（F=6.617,P=0.004）逐渐减小;不同浓度组间RRDA的RC总体上有差别（F=70.561,P＜0.001）、TE总体上有差别（F=79.659,P=0.000）、TI总体上有差别（F=21.800,P＜0.001）,IA总体上有差别（F=6.617,P=0.004）;其中2μmol/L组的作用效果最明显;2μmol/L组3 min时的RC、TI、TE、IA与5min相应指标比较没有统计学差异,P分别为0.874、0.854、0.865、0.238,即3-5分钟可以取得药物的稳定作用,选择2μmol/L作为实验的合适浓度。1.3 A68930组与A68930+SCH-23390组给予5μmol/LA68930灌流脑片,RC、TE显著缩短（P＜0.001）、IA显著增大（P＜0.001）;而且A68930的作用可以被2μmol/L SCH-23390部分逆转。2、多巴胺D1受体对mNRF区吸气神经元/双相呼气神经元放电活动的调控2.1多巴胺D1受体对吸气神经元的影响使用A68930灌流脑片5min时与正常对照比较,吸气神经元的RC缩短20.90%（P=0.000）、TE缩短21.91%（P=0.000）、Fn增加14.84%（P=0.001）、IA增加14.27%（P=0.001）,但是TI的变化不显著（P=0.825）;在A68930灌流条件下,用A68930+SCH-23390灌流脑片,A68930对吸气神经元的作用可以被SCH-23390逆转。2.2多巴胺D1受体对双相呼气神经元的作用A68930灌流脑片5min时与正常对照比较,双向呼气神经元的RC和TE均显著缩短（P=0.000）、IA和PFn均显著增加（P=0.000）,而TI的变化不显著（P=0.844）;用A68930灌流脑片条件下使用A68930+SCH-23390灌流脑片,A68930对双相呼气神经元的作用被SCH-23390所逆转。3、cAMP在多巴胺D1受体对面神经后核内侧区吸气神经元/双相呼气神经元放电活动调控中的作用3.1 IBMX、forskolin与clonidine、Rp-cAMPS对面神经后核内侧区吸气神经元/双相呼气神经元放电活动调控中的作用3.1.1 IBMX与IBMX+clonidine、forskolin与forskolin+Rp-cAMPS对吸气神经元放电活动的作用结合参考文献及所做的Rp-cAMPS、clonidine对舌下神经根节律放电活动量效曲线,实验确定IBMX、clonidine、forskolin、Rp-cAMPS四种试剂的最适浓度分别为5、10、5、10μmol/L。3.1.1.1 IBMX与IBMX+clonidine对吸气神经元放电活动的作用使用IBMX灌流脑片5min时与正常对照比较,吸气神经元的RC和TE分别缩短18.85%（P=0.003）和20.18%（P=0.003）、TI延长8.82%（P=0.000）,IA和Fn分别增加17.16%（P=0.001）和11.85%（P=0.001）。在IBMX灌流条件下,用IBMX+可乐定灌流脑片,IBMX对吸气神经元的作用可以被可乐定逆转,各观察指标基本都恢复至对照水平。3.1.1.2 forskolin与forskolin+Rp-cAMPS对吸气神经元放电活动的作用使用forskolin灌流脑片5min时与正常对照比较,吸气神经元的RC缩短18.81%（P=0.004）、TE缩短20.18%（P=0.003）、TI延长8.34%（P=0.000）,IA增加12.36%（P=0.001）、Fn增加18.96%（P=0.001）;在forskolin灌流条件下,用forskolin+Rp-cAMPS灌流脑片,forskolin对吸气神经元的作用可以被Rp-cAMPS逆转,各观察指标基本都恢复至对照水平。3.1.2 IBMX、clonidine、forskolin、Rp-cAMPS对双相呼气神经元放电活动的作用3.1.2.1 IBMX与clonidine对双相呼气神经元放电活动的作用IBMX灌流脑片5min时与正常对照相比较,双向呼气神经元的RC和TE均显著缩短（P=0.000）,IA和PFn均增加（P=0.000）,TI显著延长（P=0.003）。用IBMX灌流脑片条件下使用IBMX+clonidine灌流脑片,IBMX对双相呼气神经元的作用可以被可乐定逆转,各观察指标基本都恢复至对照水平。3.1.2.2 forskolin、Rp-cAMPS对双相呼气神经元放电活动的作用用forskolin灌流脑片5min时与正常对照相比较,双向呼气神经元的RC和TE均显著缩短（P=0.000）,分别缩短31.94%、23.53%;IA和PFn显著增加（P=0.000）,分别增加19.55%、30.60%;TI延长10.17%（P=0.012）。用forskolin灌流脑片条件下使用forskolin+Rp-cAMPS灌流脑片,与正常对照相比较,双相呼气神经元的RC、TI、TE、IA和PFn恢复至对照水平,P分别为0.746、0.683、0.679、0.815、0.827。3.2 Clonidine与Rp-cAMPS在A68930调控吸气/双相呼气神经元放电活动中的作用3.2.1吸气神经元组3.2.1.1 clonidine与clonidine+A68930对mNRF区吸气神经元放电活动的作用使用可乐定灌流脑片5min时与正常对照相比,RC和TE分别延长21.68%（P=0.001）和23.45%（P=0.000）、TI缩短12.86%（P=0.000）,同时IA和Fn分别减小11.08%（P=0.000）和12.35%（P=0.002）;用可乐定持续灌流脑片条件下,用可乐定+A68930灌流脑片,A68930对吸气神经元的兴奋作用可被可乐定阻断,与单独用可乐定灌流脑片相比较,观察指标RC、TE、TI、IA、Fn变化不显著,P值分别为0.651、0.654、0.639、0.404、0.610。3.2.1.2 Rp-cAMPS与Rp-cAMPS+A68930对吸气神经元放电活动的作用使用Rp-cAMPS灌流脑片5min时与正常对照比较,RC和TE分别延长22.04%（P=0.000）和23.81%（P=0.000）、TI缩短14.29%（P=0.000）,同时IA和Fn分别减小13.86%（P=0.000）和15.85%（P=0.000）;用Rp-cAMPS持续灌流脑片条件下,用Rp-cAMPS+A68930灌流脑片,A68930对吸气神经元的兴奋作用可被Rp-cAMPS阻断,与单独用Rp-cAMPS灌流脑片相比较,观察指标RC、TE、TI、IA、Fn变化不显著,P分别为0.716、0.688、0.704、0.605、0.579。3.2.2双相呼气神经元组3.2.2.1 clonidine与clonidine+A68930对双相呼气神经元放电活动的作用使用可乐定灌流脑片5min后与正常对照相比,RC和TE分别延长25.93%和31.99%（P=0.000）、TI缩短14.57%（P=0.005）,同时IA和Fn分别减小10.45%（P=0.001）和11.37%（P=0.000）;用可乐定持续灌流脑片条件下,使用可乐定+A68930灌流脑片,A68930对吸气神经元的兴奋作用可以被可乐定阻断,与单独使用可乐定灌流脑片相比较,观察指标RC、TE、TI、IA、PFn变化不显著,P值分别为0.389、0.945、0.337、0.774、0.668。3.2.2.2 Rp-cAMPS与Rp-cAMPS+A68930对双相呼气神经元放电活动的作用使用Rp-cAMPS灌流脑片5min后与正常对照相比,RC和TE分别延长10.78%（P=0.001）和13.41%（P=0.000）、TI缩短8.33%（P=0.035）,同时IA和PFn分别减小15.31%（P=0.000）和17.41%（P=0.000）;用Rp-cAMPS持续灌流脑片条件下,使用Rp-cAMPS+A68930灌流脑片,A68930对双相呼气神经元的兴奋作用可以被Rp-cAMPS阻断,与单独使用Rp-cAMPS灌流脑片相比较,观察指标RC、TE、TI、IA、PFn变化不显著,P分别为0.942、0.759、0.881、0.688、0.751。4、延髓面神经后核内侧区神经细胞cAMP浓度的测定采用酶联免疫吸附实验测定延髓面神经后核内侧区神经细胞cAMP浓度的测定,将mNRF“岛”在灌流槽中分别用MKS、5μmol/L A68930、2μmol/LSCH-23390灌流20分钟后用酶联免疫试剂盒测定cAMP浓度。结果显示:激动剂A68930组cAMP的浓度升高,与对照组比较有统计学差异（P=0.000）;拮抗剂SCH-23390组cAMP的浓度降低;与对照组比较有统计学差异（P=0.000）。5、多巴胺D1受体在延髓面神经后核内侧区“岛”的表达采用荧光定量PCR测定检测多巴胺D1受体在延髓面神经后核内侧区“岛”是否表达及表达的量。结果表明:mNRF“岛”区多巴胺D1受体基因有表达;与对照组（大脑前额皮质多巴胺D1受体基因的表达量）比较有统计出差异（t=-24.226,P=0.000）,延髓面神经后核内侧区“岛”多巴胺D1受体基因的表达量低于大脑前额皮质的表达量,为大脑前额皮质表达量的2-2.09倍。结论:①多巴胺D1受体对舌下神经根呼吸节律性放电活动有调节作用。②多巴胺D1调制mNRF区吸气神经元/双相呼气神经元放电活动;特异性受体激动剂增强吸气神经元/双相呼气神经元放电活动,特异性受体抑制剂抑制吸气神经元/双相呼气神经元放电活动。③多巴胺D1受体影响mNRF区神经细胞内cAMP的水平。④pre-B（o|¨）tC“岛”多巴胺D1受体有表达,相对于大脑前额皮层的表达较少。⑤forskolin与IBMX等cAMP激动剂可以兴奋吸气神经元/双相呼气神经元放电活动;Rp-cAMPS与clonidine等cAMP抑制剂可以抑制呼吸节律性放电活动。⑥Rp-cAMPS与clonidine能够阻断多巴胺D1受体对呼吸神经元放电的兴奋作用。⑦呼吸细胞内cAMP的水平调控呼吸节律性放电活动。⑧多巴胺D1受体是通过cAMP-PKA信号转导途径来调控基本呼吸节律的。
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