毛细管电泳免疫—激光诱导荧光检测技术测定氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞株中叶酰聚谷氨酸合成酶

论文摘要

背景:氨甲蝶呤（Methotrexate,MTX）是许多叶酸途径抗肿瘤药物的前体,存在L-（+）-MTX和D-（-）-MTX 2种形式的对映体,广泛应用于淋巴瘤、急性白血病和肺癌等多种肿瘤的治疗,作为MTX代谢途径中的关键酶之一的细胞内叶酰聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthetase,FPGS）,其含量和活性直接与MTX作用效果相关,已成为当今研究的热点,但有关FPGS定量检测的报道甚少。目的:建立一种FPGS定量检测方法,优化该方法实验条件,对该方法的特异性,分离度及灵敏度等进行方法学评价,并对其检测结果进行统计分析。用该方法检测不同氨甲蝶呤（MTX）对映体作用肺癌A549细胞株前后细胞株内FPGS表达含量,观察FPGS含量变化,为深入探讨肿瘤耐药机制提供新的研究平台。方法:首先利用大剂量浓度递增冲击法诱导耐药的方法分别诱导建立25μmol/L L-（+）-MTX耐药细胞株和25μmol/L D-（-）-MTX耐药细胞株,以敏感细胞株作为细胞内FPGS表达含量的对照;对湿重均约为100mg的敏感细胞株、25μmol/L L-（+）-MTX耐药细胞株和25μmol/L D-（-）-MTX耐药细胞株的三组细胞株采用液氮中反复冻融的方法,完全破坏细胞,获取细胞蛋白上清提取液;提取液经经过SDS-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）分析;细胞提取液在室温暗室里与经过透析标记法,采用异硫氰酸荧光素（ fluorescein isothiocynate,FITC）衍生标记的FPGS抗体反应30 min,使标记抗体与FPGS发生特异性非竞争性免疫反应;反应后立即采取毛细管胶束电动色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC ）法结合激光诱导荧光（laser-induced fluorescence,LIF）检测技术的毛细管电泳免疫-激光诱导荧光检测技术（immunity analysis of capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence,CEIA-LIF）分离检测FITC衍生标记FPGS以及FPGS抗原抗体复合物,检测MTX不同对映体作用肺癌A549细胞株中FPGS表达含量的。结果:经SDS-PAGE确认FPGS分子量约为66 000D,WB实验确认FPGS与其特异性抗体没有其他条带出现,并通过凝胶成像系统初步定量:25μmol/L L-（+）-MTX和25μmol/L D-（-）-MTX诱导耐药细胞中FPGS的表达含量分别为敏感细胞的52.14%和60.06%;CEIA-LIF检测方法分离标记FPGS抗体与免疫复合物的时间分别为7.1min、8.9min,且在10min内即完成蛋白的分离和检测,分离度R=4.5;CEIA-LIF检测FPGS的方法在敏感细胞株内检出限为0.6788 mg/μl细胞;运用CEIA-LIF检测细胞内FPGS的表达含量的方法,计算得出25μmol/L L-（+）-MTX和25μmol/L D-（-）-MTX诱导耐药细胞中FPGS的表达含量分别为敏感细胞的46.59%和48.36%,该结果和经典的WB初步定量结果,经SPSS 13.0 Wald模式处理软件分析得知P>0.05,说明两者没有显著差异。结论:CEIA-LIF检测FPGS方法具有检测速度快,测定时间短的特点。且通过经典的WB法做对照,该方法具有高度的特异性和FPGS定量的准确性。通过该方法中运用了FITC标记技术、MECC分离技术以及LIF检测系统,使检测特异性、敏感度大大的提高。通过建立的CEIA-LIF检测MTX不同对映体作用肺癌A549细胞株中FPGS表达含量,得出L-（+）-MTX和D-（-）-MTX诱导耐药后细胞株中FPGS表达含量较敏感细胞株明显减少,说明MTX耐药细胞株FPGS表达含量受损。

论文目录

• 1. 缩略词表
• 2. 中文摘要
• 3. 英文摘要
• 4. 正文
• 1) 前言
• 2) 材料和方法
• 3) 结果
• 4) 讨论
• 5) 结论
• 6) 研究工作的进一步设想
• 7) 参考文献
• 5. 个人简历
• 6. 致谢
• 7. 综述及参考文献