聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白为吸附标记的新型融合蛋白纯化系统

论文摘要

我们构建了一个由聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, PHA）颗粒结合蛋白Phasin、自裂解蛋白Intein和PHA纳米颗粒组成的新型融合蛋白纯化系统。要纯化的目的蛋白的基因与Phasin、Intein基因重组在一起,在Escherichia coli中表达由Phasin、Intein和目的蛋白组成的融合蛋白。融合蛋白随着菌体的破碎与其它细菌蛋白一起释放到细胞裂解液中。疏水的纳米颗粒与这些细胞裂解液共同孵育后,融合蛋白结合到颗粒的表面。离心收集结合有融合蛋白的颗粒,通过Intein的自裂解使目的蛋白从融合蛋白上裂解下来,离心使目的蛋白与剩余的Phasin和Intein融合蛋白分离。应用此方法得到了增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorecsent protein, eGFP）、谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione - S– transferase, GST）、麦芽糖结合蛋白（Maltase binding protein, MBP）和β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, LacZ）四种纯化的蛋白,并且最终得到的目的蛋白都具有较高的活性,证明此方法是一种高效可行的蛋白纯化方法。该方法可以以最低的成本生产高附加值的目的蛋白,有很高的商业价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, PHA）概述
• 1.2 PHA表面结合蛋白
• 1.2.1 PHA合酶
• 1.2.2 PHA解聚酶
• 1.2.3 PHA颗粒结合蛋白
• 1.2.4 调控蛋白
• 1.3 蛋白纯化系统的研究现状
• 1.4 PHA颗粒结合蛋白的研究现状及应用
• 1.5 本论文的目的和意义
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 分子生物学常用的工具酶
• 2.1.4 仪器和设备
• 2.1.5 常用试剂
• 2.1.6 分子量标准
• 2.1.7 试剂盒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分子生物学基本操作
• 2.2.2 蛋白含量的测定
• 2.2.3 颗粒的制备
• 2.2.4 谷胱甘肽S - 转移酶活性检测
• 2.2.5 麦芽糖结合蛋白活性检测
• 2.2.6 β–半乳糖苷酶活性检测
• 第3章 蛋白纯化过程及结果
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.1.1 PCR 克隆得到目的片段
• 3.1.2 酶切与连接
• 3.2 蛋白表达及纯化
• 3.2.1 重组菌诱导表达
• 3.2.2 融合蛋白与颗粒的结合
• 3.2.3 融合蛋白的Intein裂解
• 3.2.4 纯化蛋白的活性检测及产量测定
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文