聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白为吸附标记的新型融合蛋白纯化系统

论文摘要

我们构建了一个由聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, PHA）颗粒结合蛋白Phasin、自裂解蛋白Intein和PHA纳米颗粒组成的新型融合蛋白纯化系统。要纯化的目的蛋白的基因与Phasin、Intein基因重组在一起,在Escherichia coli中表达由Phasin、Intein和目的蛋白组成的融合蛋白。融合蛋白随着菌体的破碎与其它细菌蛋白一起释放到细胞裂解液中。疏水的纳米颗粒与这些细胞裂解液共同孵育后,融合蛋白结合到颗粒的表面。离心收集结合有融合蛋白的颗粒,通过Intein的自裂解使目的蛋白从融合蛋白上裂解下来,离心使目的蛋白与剩余的Phasin和Intein融合蛋白分离。应用此方法得到了增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorecsent protein, eGFP）、谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione - S– transferase, GST）、麦芽糖结合蛋白（Maltase binding protein, MBP）和β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, LacZ）四种纯化的蛋白,并且最终得到的目的蛋白都具有较高的活性,证明此方法是一种高效可行的蛋白纯化方法。该方法可以以最低的成本生产高附加值的目的蛋白,有很高的商业价值。

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第1章前言

1.1 聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, PHA）概述

1.2 PHA表面结合蛋白

1.2.1 PHA合酶

1.2.2 PHA解聚酶

1.2.3 PHA颗粒结合蛋白

1.2.4 调控蛋白

1.3 蛋白纯化系统的研究现状

1.4 PHA颗粒结合蛋白的研究现状及应用

1.5 本论文的目的和意义

第2章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 引物

2.1.3 分子生物学常用的工具酶

2.1.4 仪器和设备

2.1.5 常用试剂

2.1.6 分子量标准

2.1.7 试剂盒

2.2 实验方法

2.2.1 分子生物学基本操作

2.2.2 蛋白含量的测定

2.2.3 颗粒的制备

2.2.4 谷胱甘肽S - 转移酶活性检测

2.2.5 麦芽糖结合蛋白活性检测

2.2.6 β–半乳糖苷酶活性检测

第3章蛋白纯化过程及结果

3.1 重组质粒的构建

3.1.1 PCR 克隆得到目的片段

3.1.2 酶切与连接

3.2 蛋白表达及纯化

3.2.1 重组菌诱导表达

3.2.2 融合蛋白与颗粒的结合

3.2.3 融合蛋白的Intein裂解

3.2.4 纯化蛋白的活性检测及产量测定

第4章讨论

第5章结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文

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