蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质研究

论文摘要

大蒜（Allium Sativum L）是百合科葱属植物,为历史悠久的药食两用植物。大蒜中主要的功效物质是由大蒜蒜氨酸酶（EC 4.4.1.4）催化裂解蒜氨酸（Alliin）产生的大蒜素等一系列含硫化合物。从新鲜大蒜中分别提取蒜氨酸酶和蒜氨酸并将其制成蒜类药品和保健品是大蒜深加工的研究发展方向。本论文通过在磷酸缓冲液保护下破碎浸提、硫酸铵分级沉淀、葡聚糖凝胶G-200吸附等步骤自新鲜大蒜鳞茎中分离纯化出蒜氨酸酶,采用测丙酮酸法测定蒜氨酸酶活性,比较蒜氨酸酶活性确定蒜氨酸酶的分离纯化条件,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蒜氨酸酶分子量,进一步确定蒜氨酸酶的纯度;以分离纯化后的蒜氨酸酶作为供试液,以合成的S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜为底物,研究蒜氨酸酶的酶学性质;结合蒜氨酸酶的酶学性质,采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究酶调控技术对大蒜素得率的影响。结果表明:1、蒜氨酸酶的分离纯化过程中,粗酶液盐析分离（NH4）2SO4的适宜饱和度为45%,经超滤除盐后酶液上Sephadex G-200柱,凝胶层析分离时蒜氨酸酶集中洗脱时间为3.25～5.75h范围,最适洗脱时间为4.75h。上述提纯步骤得到酶活回收率为64.7%,纯化倍数16.2倍的蒜氨酸酶,经SDS-PAGE电泳鉴定没有杂蛋白带,基本为单一组分,分子量测得为52.6KD。2、苯酚硫酸法测得蒜氨酸酶的含糖量为2.25%,等点聚焦电泳测得蒜氨酸酶的pI值为4.9;热稳定性和pH稳定性实验表明,:蒜氨酸酶的热稳定性较差,蒜氨酸酶活性随着温度增大和放置时间的延长而不断下降,20℃酶活相对稳定,而蒜氨酸酶在pH值为5.7-7.0弱酸性环境下则更有利于保持蒜氨酸酶的酶活性;蒜氨酸酶酶促反应最适温度为30℃,最适pH值为6.3,以S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜为底物测得米氏常数为5.91mmol.L-1,最大反应速度为1.55umol.min-1。多羟基化合物以及大多数金属离子化合物等对蒜氨酸酶活性有明显的激活和抑制效果。Mg2+、zn2+、Fe2+、Fe3+、EDTA-Na金属离子对蒜氨酸酶有激活作用,Fe3+激活作用最明显,Cu2+严重抑制蒜氨酸酶活性。3、运用酶调控技术提高大蒜素产率过程中,影响大蒜素产率的调控因素依次为酶解温度、酶解pH、酶解时间、Fe3+浓度,四因素最佳组合为A1B2C2D3,即酶解温度30℃,酶解pH6.3,酶解时间20min,Fe3+浓度取10mmol/L;在此条件下重复验证实验,测得大蒜素得率为0.231%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 大蒜
• 1.1.1 大蒜的化学组成和功能成分
• 1.1.2 大蒜的生理功效
• 1.2 大蒜风味物质的形成机理
• 1.3 大蒜风味物质的提取及测定方法
• 1.3.1 大蒜风味物质的提取方法
• 1.3.2 大蒜素的检测方法
• 1.4 国内大蒜产业的现状与前景
• 1.5 大蒜蒜氨酸酶的研究现状
• 1.5.1 蒜氨酸酶的结构
• 1.5.2 蒜氨酸酶的分离纯化
• 1.5.3 蒜氨酸酶的酶学性质
• 1.5.4 影响蒜氨酸酶稳定性的因素
• 1.5.5 蒜氨酸酶的基因表达及其调控
• 1.5.6 蒜氨酸酶酶活的测定
• 1.6 本课题研究目的和意义
• 1.7 本课题研究的内容
• 第2章 蒜氨酸酶的分离与纯化
• 2.1 材料、试剂与仪器设备
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 试剂的配制
• 2.2.2 酶活的测定
• 2.2.3 底物S-烯丙基-半胱氨酸亚砜的制备
• 2.2.4 蒜氨酸酶的分离与纯化
• 2.2.5 SDS-PAGE不连续垂直板电泳对蒜氨酸酶纯度的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 分级沉淀中不同硫酸按饱和度的选择
• 2.3.2 蛋白质脱盐方法的选择
• 2.3.3 Sephadex G-200柱层析纯化蒜氨酸酶
• 2.3.4 蒜氨酸酶的分离纯化结果
• 2.3.5 SDS-PAGE电泳对蒜氨酸酶的纯度鉴定及分子量的测定
• 2.4 本章小结
• 第3章 蒜氨酸酶的酶学性质测定
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 蒜氨酸酶含糖量的测定
• 3.2.2 等点聚焦电泳法测定蒜氨酸酶的pI
• 3.2.3 酶促反应最佳反应时间的确定
• m的测定'>3.2.4 最佳底物浓度和测定米氏常数K_m的测定
• 3.2.5 确定蒜氨酸酶的热稳定性
• 3.2.6 确定蒜氨酸酶的PH稳定性
• 3.2.7 酶反应的最适温度
• 3.2.8 酶反应的最佳pH
• 3.2.9 蒜氨酸酶的激活与抑制
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 蒜氨酸酶含糖量的测定
• 3.3.2 等点聚焦电泳法测定蒜氨酸酶的pI值
• 3.3.3 酶促反应最佳反应时间的测定
• 3.3.4 最佳底物浓度和蒜氨酸酶常数的测定
• 3.3.5 确定蒜氨酸酶的热稳定性
• 3.3.6 确定蒜氨酸酶的pH稳定性
• 3.3.7 酶反应的最适温度
• 3.3.8 酶反应的最佳pH
• 3.3.9 蒜氨酸酶活的激活与抑制
• 3.4 本章小结
• 第4章 酶调控技术提高大蒜素得率的研究
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 原料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 工艺流程
• 4.2.2 萃取条件对大蒜素得率的影响
• 4.2.3 酶解条件对大蒜素得率的影响
• 4.2.4 正交试验优化蒜氨酸酶综合调控的最佳工艺条件
• 4.2.5 大蒜素的含量测定
• 4.2.6 相关计算公式
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 萃取条件对大蒜素得率的影响
• 4.3.2 酶解条件对大蒜素得率的影响
• 4.3.3 蒜氨酸酶综合调控的最佳工艺条件
• 4.4 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 问题与建议
• 5.3 进一步工作的方向
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文