论文摘要
谷胱甘肽（glutathione,GSH）是一种重要的非蛋白巯基化合物,具有清除自由基、解毒、增强免疫力等功能。目前,GSH已经被作为重要的功能因子,广泛应用于食品生产等领域。本论文以食品发酵生产中的重要菌株旧金山乳杆菌DSM20451T、乳酸乳球菌SK11和代谢工程研究中重要的基因工程宿主菌乳酸乳球菌NZ9000为实验菌株,以研究冷冻胁迫和酸胁迫状态下GSH对乳酸菌的生理调控方式为目标,详细阐述了冷冻胁迫和酸胁迫下乳酸菌细胞的生理状态以及GSH对乳酸菌生理活性和结构形态的影响,并对其作用机理进行了较为深入的探讨。主要研究结果如下:1.旧金山乳杆菌DSM20451T自身不能合成GSH,但具有从外界吸收GSH的能力,并且细胞内GSH的积累随外源添加量和添加时间的增加而增加。在MRS培养基中,当外源GSH添加量为4.8 mmol·L-1时,旧金山乳杆菌DSM20451T细胞内的GSH浓度为20.03±0.07 （nmol·mg protein-1）,此时细胞对GSH的吸收趋于饱和。2. GSH对前培养至稳定中后期（36 h）的旧金山乳杆菌DSM20451T细胞的抗冷冻保护作用最为显著,在4°C和-20°C下胁迫30 d后,旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）细胞的存活率分别是（GSH-）细胞的8.43倍和6.40倍;经过4°C和-20°C冷冻胁迫15 d后,在重培养过程中DSM20451T（GSH+）细胞比DSM20451T（GSH-）细胞的生长延滞期分别缩短了13.5 h和12 h。3. GSH不影响正常环境下旧金山乳杆菌DSM20451T细胞的生长和代谢活性;在冷冻胁迫条件下,GSH缓解了代谢关键酶（3-磷酸甘油醛脱氢酶,GAPDH;丙酮酸激酶,PK;乳酸脱氢酶,LDH）活性的下降;同时,冷冻胁迫过程中的DSM20451T（GSH+）保持了较高的胞内ATP水平,-20°C胁迫20 d后,旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）和（GSH-）的胞内ATP浓度分别为胁迫处理前的6.4%和1.9%。同时,作为影响细胞存活率重要因素的胞内pH（pHi）在冷冻胁迫下的旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH-）细胞内显著降低,而旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）细胞的pHi在该过程中始终高于胁迫前的初始值。上述结果表明GSH对冷冻胁迫下细胞代谢活性、能量水平和pHi动态平衡的调节对提高旧金山乳杆菌DSM20451T细胞冷冻胁迫抗性具有重要意义。在重培养过程中的生长延滞期内,旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH-）细胞的代谢关键酶活性无显著变化,而旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）细胞的PK和GAPDH活性分别增至重培养初始值的3.17倍和1.66倍。同时,冷冻胁迫过程中减少的胞内GSH浓度在重培养过程中也呈现出上升趋势,重培养18 h后胞内GSH浓度为冷冻胁迫处理前的78.8%。从细胞内GSH浓度与上述酶的活性变化关系,推测GSH在冷冻过程中对代谢关键酶的保护与“硫醇化”作用有关。4.在冷冻胁迫过程中,GSH能够显著保护旧金山乳杆菌DSM20451T细胞的细胞膜完整性和平滑度并提高细胞膜不饱和脂肪酸成分的比例。冷冻胁迫处理前,旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）与（GSH-）细胞膜具有相似的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比值（U/S值）,然而随着4°C下冷冻胁迫的进行,旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）与（GSH-）的U/S值差距逐渐增大,胁迫14 d后DSM20451T（GSH+）的U/S值是（GSH-）的2.44倍。5.冷冻胁迫下GSH对旧金山乳杆菌DSM20451T细胞膜的保护作用与防止细胞膜脂质的氧化和对细胞膜上某些关键酶的保护作用有关。在冷冻胁迫过程中,旧金山乳杆菌细胞内的氧化还原状态发生了显著的变化:[NAD+]/[NADH]比值持续上升,SOD活性和胞内巯基水平（包括蛋白巯基和非蛋白巯基）下降,上述结果表明冷冻胁迫诱发了细胞内氧胁迫的产生。在该过程中,GSH阻止了细胞膜不饱和脂肪酸（如亚油酸）的氧化,对维持细胞膜的流动性发挥了重要作用。此外,控制细胞膜渗透性和质子梯度的关键膜蛋白Na+,K+-ATPase在旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH-）细胞内活性迅速下降,而（GSH+）细胞内的Na+,K+-ATPase活性在4°C和-20°C冷冻胁迫30 d后,仍然保持了胁迫前初始值的75.8%和82.1%,表明冷冻胁迫下GSH对Na+,K+-ATPase具有显著的保护作用。6.通过二维电泳和飞行质谱技术对冷冻胁迫前后细胞的蛋白质差异点进行分析得知,GSH对正常生长条件下细胞的生理状态没有构成显著影响;冷冻胁迫处理后旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）和（GSH-）的蛋白点总数和差异点均高于冷冻胁迫前的同类型样本,表明冷冻胁迫使细胞的蛋白表达发生了一定的变化。进一步的研究证实,GSH通过在蛋白质水平调控与细胞代谢活性相关的酶类（如β-葡萄糖磷酸变位酶和磷酸乙酰基转移酶）、胁迫应激蛋白（如UspA、β-葡萄糖磷酸变位酶和磷酸乙酰基转移酶）、氧化还原酶（如谷胱甘肽过氧化物酶）以及与DNA复制、蛋白质转录、翻译相关的酶增强了旧金山乳杆菌DSM20451T细胞的冷冻胁迫抗性。7. GSH具有保护旧金山乳杆菌DSM20451T、乳酸乳球菌SK11和乳酸乳球菌NZ9000抵抗酸胁迫的作用,其作用效果对前培养至稳定后期的细胞最为显著。pH4.0胁迫10 h后旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）、SK11（GSH+）和NZ9000（pNZ3203）细胞的存活率分别是对照菌的6.14倍、15.9倍和18.0倍;pH2.5胁迫30 min后SK11（GSH+）和NZ9000（pNZ3203）细胞的存活率分别为对照细胞的17.2倍和15.0倍。GSH提高细胞酸胁迫抗性的作用机制主要通过缓解胞内pH下降和保护代谢关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶实现。此外,外源GSH与细胞自身合成的GSH存在着作用方式上的差异,在酸胁迫过程中,SK11（GSH+）胞内的GSH被大量消耗,pH4.0胁迫4 h后残余的胞内GSH仅为初始值的7.6%,即外源GSH主要以“自杀式”消耗方式发挥其酸胁迫下的保护作用,而NZ9000（pNZ3203）细胞内的GSH以低消耗的方式对酸胁迫下的细胞进行保护。