猪圆环病毒2型地方株的分离鉴定和诊断方法的建立及应用

论文摘要

猪圆环病毒病由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）所致，该病除表现为猪断乳后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）外，还可为猪皮炎与肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、怀孕母猪的繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤（Congenital tremors，CT）、增生性坏死性肺炎（Proliferative and necrotizing pneumonia，PNP）。目前，国内外学者对该病的致病机制、流行病学、诊断方法、免疫机制等进行了深入的研究。现有的检测方法在PCV2感染早期难以与PCV1鉴别诊断，而且PCV2疫苗仍未研制成功并应用于生产实际。因此建立敏感、特异、检出率高的抗原和抗体检测方法对于防控PCV2感染愈显重要。本研究首先在具有典型PMWS猪群中进行PCV2地方株分离，并对分离株进行全基因克隆、序列测定与分析，在此基础上建立了PCV2 PCR检测方法；扩增并克隆了PCV2地方株Cap基因的氨基端和羧基端，构建了重组表达质粒，并进行了原核高效诱导表达。利用表达的重组蛋白建立了PCV2间接ELISA方法，并作为免疫原，免疫BALB／c小鼠，制备和筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株；制备了具有PCV2特异性的单抗作为包被抗体，建立了双抗体夹心ELISA检测方法。上述检测方法应用于现地样品检测。从江西、黑龙江大庆两地PMWS猪群中分离到3株病毒，通过电镜观察、序列分析、PCR、外源病毒检测等鉴定结果表明为PCV2，分别命名为PCV2-S2、PCV2-P11、PCV2-L。对这3个分离株进行了全基因克隆、序列测定与分析，结果表明PCV2-S2、PCV2-P11和PCV2-L基因组序列长度分别为1767nt、1767nt和1768nt。测序结果提交了GenBank，序列号分别为AY288133（S2）、AY288134（P11）和AY288135（L）。通过与GenBank中已知的PCV序列进行同源性比较，分析PCV的系统发育进化关系，建立了PCV的系统发育进化树。根据PCV2的核苷酸序列及推导氨基酸序列的差异性结果分析显示，分离的PCV2-S2、PCV2-P11两株属于欧洲型，PCV2-L株属于美洲型。本研究设计了既能检测PCV，又能区分PCV1和PCV2的两对引物，优化了反应条件，确定了各组分最佳工作浓度，可分别特异性扩增PCV和PCV2核酸，不能扩增PPV、PRRSV、SIV和PK-15细胞核酸，建立了敏感、特异的PCV2 PCR诊断方法，并测序鉴定了PCR扩增产物。自2002年以来，先后对来自山东、上海、黑龙江、河南、辽宁、青海、广东、北京、吉林、江西、山西和天津等12省（市）具有PMWS症状的猪现地样品513份进行了PCV2 PCR检测，确定了115份样品PCV2 PCR阳性，阳性率为22.0％，其中河南阳性率较高，达75.0％；青海阳性率为0％；其他省（市）阳性率在6.0％-48.0％之间。对来自黑龙江大庆、靠河寨和吉林公主岭具有PMWS症状的3个猪场现地样品检测，确定PCV2 PCR的阳性率在5.1％-73.7％之间，其中2002年3月-4月，大庆某猪场的78份样品中PCV2 PCR阳性数为4份，阳性率为5.1％；2002年4月-6月，靠河寨某猪场的78份样品中PCV2 PCR阳性数为9份，阳性率为11.5％：2003年-2005年，公主岭某猪场的38份样品中PCV2 PCR阳性数为28份，阳性率为73.7％。结果表明上述省（市）PCV2感染程度虽然不同，但不同地区猪场具有PMWS症状猪与PCV2感染有相关性，且PCV2感染表现为上升趋势。扩增并克隆了PCV2-L的基因组和Cap基因，获得了重组质粒pMDT-PCV和pMDT-cap。利用ORF2基因内部中间部位的EcoRI位点，将ORF2基因分成氨基端和羧基端两部分，构建了重组表达质粒pGEX-PCV737-421和pGEX-PCV421-37，并分别进行了原核高效诱导表达，获得了重组蛋白PCV737-421和重组蛋白PCV421-37，表达量分别为19.2％和13.4％。重组蛋白PCV737-421和重组蛋白PCV421-37制备的小鼠免疫血清均可特异性检测到PCV2-L。利用重组蛋白PCV421-37建立了PCV2间接ELISA，与IFA对比试验表明二者符合率达83.4％。2005年，对黑龙江、吉林和河南3个省4个具有PMwS症状的猪场共40份血清样品进行了PCV2间接EUSA检测，阳性数为35份，阳性率达87.5％。利用重组蛋白PCV737-421和重组蛋白PCV421-37作为免疫原，通过杂交瘤细胞技术，IFA方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞21株。利用重组蛋白PCV737-421作为免疫原，筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞16株，其中单抗8B7-B1、9E2-A10和9B6-A7仅与PCV2感染PK15细胞有IFA反应性，而与PCV1感染PK15细胞没有IFA反应性，为PCV2特异性；其余13株与PCV2和PCV1均有IFA反应性，为PCV特异性；利用重组蛋白PCV421-37作为免疫原，筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞5株，均与PCV2和PCV1有IFA反应性，为PCV特异性。亚型鉴定结果表明，3株单抗3F4-D10、9B4-D8和26H5-A3为IgG1亚类，其余18株均属于IgM亚类；21株单抗的轻链均属于κ链。利用单抗986-A7腹水作为包被抗体，建立了敏感、特异的PCV2双抗体夹心ELISA检测方法。方阵试验确定了各组份的最佳工作浓度；与PCV1、SIV、PRV、PRRSV、PPV特异性试验表明具有PCV2特异性。与PCV2 PCR对比试验表明26份PCV2双抗体夹心ELISA阳性样品，PCV2 PCR检测均为阳性；14份PCV2双抗体夹心ELISA阴性样品，PCV2 PCR检测阳性为6份，显示两种检测方法符合率为85％。2003年以来，对黑龙江、河南、吉林、江西等4省疑似PCV2感染的现地猪病料样品133份进行了检测，结果PCV2双抗体夹心ELISA阳性为117份，阳性率为87.9％，表明PCV2有较高的感染率。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 猪圆环病毒与猪圆环病毒病研究进展
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 临床症状
• 4 病理学
• 5 诊断
• 6 免疫及防制
• 7 存在问题
• 第二篇 应用研究
• 第二章 猪圆环病毒2型地方株的分离鉴定
• 1 材料方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 猪圆环病毒2型PCR诊断方法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 猪圆环病毒2型间接ELISA诊断方法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA诊断方法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间获得成果、出版著作和论文发表目录
• 致谢