新城疫病毒血凝素—神经氨酸酶基因作为分子佐剂的抗肿瘤作用研究

论文摘要

尽管许多肿瘤的基因治疗策略旨在以消灭肿瘤细胞为最终目标，抑制肿瘤生长，并赋予较长生存时间，增强抗肿瘤免疫反应并诱导长期免疫监视同样重要。先天免疫应答不仅在适应性免疫应答的诱导中起着重要的作用，且具有抗癌活性。因此，通过激发先天免疫系统的新的治疗策略，在提高抗肿瘤活性方面或许具有一定的积极作用。分子佐剂是一种可以协同刺激适应性和先天免疫反应的分子。此外，这些佐剂不仅可以激活NK细胞，而且可以刺激先天免疫系统产生细胞因子。因此，关于这些分子的研究主要集中在疫苗开发方面。虽然目前只有两种佐剂批准应用于临床，而其他分子佐剂，包括细胞因子，细菌产物，热休克蛋白，病毒样颗粒，免疫刺激复合物均已进行了广泛的研究。然而，许多分子佐剂因其副作用而不能应用于临床。本研究中，我们致力于使用一种完全无毒的佐剂，即NDVHN作为分子免疫佐剂。在早期研究中，我们获得了一种基于肿瘤细胞选择性诱导凋亡基因的溶瘤腺病毒Ad-Apoptin。Ad-Apoptin可以产生较强的抗肿瘤和体外诱导细胞凋亡作用，而且对体内实体肿瘤具有显著的抗癌活性。此外，Ad-Apoptin具有抑制肿瘤转移的能力。近来发现，通过系统给药Ad-Apoptin可以直接抑制肿瘤生长。基于Ad-Apoptin的治疗特性，我们致力于评价使用重组腺病毒作为抗肿瘤基因治疗的候选策略。然而，重组体缺少免疫刺激能力，这使得它不能获得长时间的抗肿瘤活性。新城疫病毒属于副粘病毒属，负股单链RNA病毒，通常导致大量家禽呼吸道和胃肠道的炎症。HN是一个74kDa的多功能膜II类糖蛋白，是NDV的主要结构蛋白之一。该蛋白不仅介导唾液酸包含受体的识别，而且具有NA，可以将唾液酸从这些受体上分离。研究表明，HN可以刺激外周血单个核细胞（PBMC）中干扰素-α应答。HN蛋白能促使T细胞产生共刺激功能并诱导先天免疫活性，且HN也具有I型干扰素的诱导能力。此外，NDV HN通过触发NKp44和NKp46的受体直接激活人体NK细胞。抗肿瘤免疫可以是先天的或是适应的。虽然适应性抗肿瘤免疫活性可以诱导对特定抗原的反应，诱导产生持久免疫记忆，并对正常组织的毒性低，但先天免疫方法也可能是有益的。事实上，一般认为最有效的免疫抗瘤反应是先天的免疫方法。NK细胞是先天免疫系统的重要组成部分，其特点是快速应答并有极强的杀伤活性，而无需预先致敏及主要组织相容性分子的参与。NK不仅能够通过NK细胞表面表达的TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL）、Fas配体（FasL）或通过NK细胞分泌的TNF-α来实现细胞毒性作用，而且可能通过产生IFN-γ、白细胞介素和生长因子调节免疫应答。此外，在免疫应答过程中，NK细胞产生的许多趋化因子对树突状细胞（DC）、巨噬细胞和中性粒细胞产生影响。本研究采用NDV HN激活NK、DC和单核细胞，并稳定激活T细胞，这突显了HN基因佐剂在肿瘤治疗方面的潜在活性。在这项研究中，我们采用HN作为肿瘤治疗的一个潜在的分子免疫佐剂。研究表明，Ad-HN能够在体外诱导外周血单个核细胞分泌淋巴因子效应细胞因子。此外，Ad-HN佐剂与对照佐剂相比，促使减少肿瘤的生长并提供生存益处。因此，HN在肿瘤基因治疗方面是一个合适的免疫佐剂。本研究表明SGC7901细胞中成功表达的HN可执行NA和HA的功能。我们进一步确定含HN的SGC7901细胞可诱导PBMCs分泌淋巴因子效应细胞因子TNF-α，IFN-α和IFN-γ的增加。TNF-α可促进巨噬细胞的抗肿瘤细胞毒作用，NK细胞释放的IFN-γ能促进Th1细胞极化和随后的细胞毒T淋巴细胞的诱导。此外，IFN-α具有抗肿瘤作用以及对免疫细胞的多种活性。所有这些均有助于各种直接和间接的抗肿瘤效应的功能。接着，我们表明，NK细胞与Ad-HN感染的SGC7901细胞孵育后可增强NK细胞对未感染靶细胞的杀伤能力，这将有助于体内的溶瘤作用。我们还设置了HN佐剂与Ad-Apoptin联合应用的治疗肿瘤模型，实验数据显示，用Ad-Apoptin治疗并随后用Ad-HN作为佐剂辅助治疗与单独Ad-Apoptin治疗的荷瘤小鼠相比肿瘤负荷减少。我们还观察到应用NDV HN作为免疫佐剂实验组具有明显的生存益处。这可能是由于凋亡素基因和HN之间的协同反应。因为凋亡素可以阻碍肿瘤的迅速增长，同时，HN建立了免疫防御防止肿瘤的渗透，扩散和转移。总之，体外实验和缺乏适应性免疫系统体内肿瘤模型结果表明，先天免疫反应，尤其是NK细胞，通过佐剂HN在抑制同基因移植和改善平均生存期方面起着关键的作用。结果进一步加强了HN基因在肿瘤的治疗上潜在的佐剂活性。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• Abstract
• 绪论
• 第1章 I 型病毒膜糖蛋白的生物特性研究综述
• 1.1 流感病毒血细胞凝集素模型
• 1.1.1 分子首先被定位“头部”
• 1.1.2 裂解时发生的最小结构改变
• 1.1.3 中央卷曲螺旋的定位
• 1.1.4 融合肽和膜固着点的共区域化
• 1.1.5 融合激活
• 1.2 常见的后融合结构
• 1.3 副粘病毒融合蛋白结构
• 1.3.1 分子的定位很可能是“头部”
• 1.3.2 裂解时发生的最小结构改变
• 1.3.3 中央卷曲螺旋的定位
• 1.3.4 融合肽和膜固着点的共区域化
• 1.3.5 融合激活
• 1.4 GP120 在 HIV 融合激活中的作用
• 1.5 融合抑制因子和中间结构
• 第2章 肿瘤实验性治疗动物模型研究综述
• 2.1 小鼠治疗模型的价值
• 2.2 一种差异性解决方案
• 2.3 小鼠体内实验获得的一些相关临床结果
• 2.4 有效的抗转移治疗
• 2.5 晚期 CNS 转移的发生
• 2.6 转移模型利弊分析
• 2.7 肝细胞癌（HCC）的动物模型
• 2.7.1 肝癌形成模型
• 2.7.2 HCC 转移模型
• 2.7.3 HCC 治疗模型
• 第3章 表达 NDV HN 溶瘤腺病毒有效抑制 SGC7901 增殖
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 感染剂量对重组溶瘤腺病毒抑制人胃癌细胞 SGC7901 作用的影响
• 3.2.2 感染剂量对重组溶瘤腺病毒抑制人胚肝细胞 L02 作用的影响
• 3.2.3 感染时间对重组溶瘤腺病毒抑制人胃癌细胞 SGC7901 作用的影响
• 3.2.4 感染时间对重组溶瘤腺病毒抑制人胚肝脏细胞 L02 作用的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 肿瘤的病毒治疗
• 3.3.2 肿瘤的免疫治疗
• 3.3.3 NDV 在肿瘤治疗中的应用前景
• 3.3.4 NDV 的免疫刺激特性
• 3.4 小结
• 第4章 表达 NDV HN 溶瘤腺病毒诱导 SGC7901 细胞凋亡
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 AO/EB 染色结果
• 4.2.2 台盼蓝染色检测细胞坏死
• 4.2.3 DAPI 染色法观察细胞核变化
• 4.2.4 Annexin V-FITC 检验细胞凋亡
• 4.3 讨论
• 4.3.1 细胞凋亡检测方法
• 4.3.2 细胞坏死的检测方法
• 4.3.3 细胞自噬的检测方法
• 4.4 小结
• 第5章 表达 NDV HN 溶瘤腺病毒诱导 SGC7901 细胞凋亡途径
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 Caspase-3、Caspase-6 和 Caspase-7 活性检测结果
• 5.2.2 MMP 检测结果
• 5.2.3 ROS 检测结果
• 5.2.4 Western blot 分析结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 以线粒体渗透性转变为靶向
• 5.3.2 作用于通透性转换孔复合体（PTPC）成分的化合物
• 5.3.3 4-（N-（S-谷胱甘肽酰氯）氨基）
• 5.3.4 诱导 ROS 过度产生的化合物
• 5.4 小结
• 第6章 表达 NDV HN 溶瘤腺病毒的体内免疫佐剂作用
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 HA 检测结果
• 6.2.2 NA 检测结果
• 6.2.3 细胞因子检测结果
• 6.2.4 NK 细胞杀伤检测结果
• 6.2.5 生存期检测结果
• 6.2.6 给药后各试验肿瘤生长趋势
• 6.3 讨论
• 6.3.1 GISTs 的致癌突变
• 6.3.2 GIST 进展过程中染色体和分子改变
• 6.3.3 GISTs 的起源
• 6.3.4 激酶突变和 TKI 治疗
• 6.3.5 靶向 KIT 和 PDGFRA 的其他 TKIs
• 6.4 小结
• 第7章 结论
• 第8章 创新点
• 参考文献
• 作者简介及在攻读学位期间所取得的科研成果
• 致谢