Mfn2基因抑制血管平滑肌细胞增殖的功能序列及肽研究

论文摘要

第一部分携带Mfn2基因不同结构序列的重组腺病毒的构建、扩增和纯化1.目的采用DNA重组技术,构建、制备、鉴定、扩增和纯化含线粒体融合素2基因（Mitofusin 2, Mfn2）不同结构序列的重组腺病毒。2.方法利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）扩增大鼠Mfn2不同区段的互补DNA （cDNAs）,将PCR产物连接到TA克隆载体（pCR8/GW/TOPO）上,筛选出含有正确片段的质粒。利用Gateway方法将含有正确片段的重组质粒与腺病毒目的质粒（pAd/CMV/V5-DEST）,在LR Clonase的帮助下进行重组反应。用PacI将所得到的重组腺病毒载体切开,再利用脂质体（Lipofectamine 2000）包装后转染到293细胞中,产生重组的腺病毒。经测序鉴定无误后进行大量扩增,利用氯化铯密度梯度离心法,超高速离心纯化病毒,分装冻存于-80℃中。用紫外分光光度仪测定病毒液光密度（Optical density, OD）值,计算病毒滴度。采用Western blot方法检测目的基因在大鼠血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells, VSMCs）中的表达。3.结果8种目的基因结构序列（1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A）正确,通过PCR鉴定可检测到相应条带。8种重组腺病毒的滴度分别为27.8×109 pfu/ml、24×109 pfu/ml、19×109 pfu/ml、30.8×109 pfu/ml、6.7×109 pfu/ml、12.7×109 pfu/ml、27.6×109 pfu/ml、11.8×109 pfu/ml。Western blot检测结果显示相应的Mfn2蛋白表达。4.结论利用DNA重组技术可成功构建携带Mfn2基因不同结构序列的重组腺病毒,并通过扩增和纯化获得大量高滴度的病毒液,为进一步研究其对VSMCs增殖和凋亡的影响奠定了基础。第二部分Mfn2基因不同结构序列对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响1.目的研究大鼠线粒体融合素2基因（Mitofusin 2, Mfn2）不同结构序列对大鼠血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells, VSMCs）增殖和凋亡的影响,寻找能有效抑制VSMCs增殖和促进凋亡的最小cDNA （scDNA）,并探讨其相关的信号通路。2.方法利用携带Mfn2基因不同结构序列的重组腺病毒感染大鼠VSMCs.采用细胞计数法、水溶性四氮唑盐（WST-8,CCK-8）法比较其对VSMCs增殖的影响；流式细胞术比较各组细胞周期的变化；流式细胞术和细胞凋亡ELISA观察各组对VSMCs凋亡的影响；Western blot法分析各组磷酸化Raf-1 （p-Raf-1）、磷酸化ERK1/2 （p-ERK1/2）、磷酸化Akt （p-Akt）蛋白表达的变化。3.结果细胞计数和CCK-8结果显示,与对照组相比,Mfn2基因不同结构序列对VSMCs的增殖均有不同程度的抑制作用（P<0.01）,其中以1A、4A和8A的抑制效果最明显；流式细胞仪细胞周期检测结果表明,Mfn2基因不同结构序列较对照组均能不同程度使VSMCs生长停滞于G0/G1期（P<0.01）,其中以1A、4A和8A最为明显,进入S期的细胞比例分别为（59.85±3.26）%、（34.73±2.65）%和（60.73±2.69）%；流式细胞仪Annexin V-FITC细胞凋亡检测结果表明,与对照组相比,1A、4A和8A均有明显的促VSMCs凋亡作用（P<0.01）,且呈时间依赖性（48h-72h）；细胞凋亡ELISA结果显示,与对照组相比,1A、4A和8A均有显著的促VSMCs凋亡作用（P）<0.01); Western blot检测结果显示,1A、4A和8A的p-Raf-1、p-ERK1/2和p-Akt表达水平较对照组均有明显降低（P<0.01）。4.结论与Mfn2全长序列（8A, Adv-Mfn2）和去除穿膜区的Mfn2序列（4A, Adv-tMfn2）相比,Mfn2最小结构序列1A同样具有显著抑制VSMCs增殖的作用,使细胞周期停滞于G0/G1期,这一作用主要是使Ras-Raf-ERK1/2通路受到抑制,p-Raf-1和p-ERK1/2的表达下调,从而发挥抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。此外,1A也具有促VSMCs凋亡的作用,该作用主要是通过抑制.Ras-PI3K-Akt信号通路而实现。第三部分Mfn2基因相关合成肽对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响1.目的研究Mfn2基因相关合成肽（Mfn2 gene-related synthetic peptide, MRSP）对大鼠血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells, VSMCs）增殖和凋亡的影响,并探讨其相关的信号通路。2.方法在Mfn2最小功能序列1A的C端加上TAT穿膜多肽,人工合成MRSP。采用细胞计数法、水溶性四氮唑盐（WST-8, CCK-8）法观察不同浓度的MRSP（1μM、10μM、25μM、50μM、100μM）对VSMCs增殖的影响；流式细胞术比较不同浓度MRSP对VSMCs细胞周期的影响；细胞凋亡ELISA和流式细胞术观察MRSP对VSMCs凋亡的影响；Western blot法分析各组磷酸化Raf-1 （p-Raf-1）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化Akt （p-Akt）蛋白表达的变化。3.结果人工合成MRSP为白色冻干粉末,纯度97.2%,分子量3305,水溶性良好（PBS中的溶解度为1mg/ml）。细胞计数和CCK-8结果均显示,与对照组相比,MRSP在10μM～100μM范围内可成剂量和时间依赖性的抑制VSMCs的增殖（P<0.01）。流式细胞仪细胞周期检测结果表明,不同浓度的MRSP （10μM、25μM.50μM）较对照组均能使VSMCs生长停滞于G0/G1期（P<0.01）,G0/G1期的细胞比例分别为（24.90±3.46）%、（36.85±3.57）%和（62.45±2.83）%；流式细胞仪Annexin V-FITC细胞凋亡检测结果表明,与对照组相比,随着时间的延长（24h、48h、72h）,25μM MRSP可有效诱导VSMCs的凋亡,作用72h时的细胞凋亡率为（30.4±2.1）%（P<0.01）；细胞凋亡ELISA结果表明,随着时间的延长,25μM MRSP与对照组相比有显著的促VSMCs凋亡作用（P<0.01）；Western blot检测结果显示,与对照组相比,MRSP可成浓度依赖性（10μM、25μM、50μM）的抑制p-Raf-1、p-ERK1/2和p-Akt的表达水平（P<0.01）。4.结论根据Mfn2的最小功能序列人工合成的MRSP具有显著抑制VSMCs增殖的作用,使细胞周期停滞于G0/G1期,这一作用主要是使Ras-Raf-ERK1/2通路受到抑制,p-Raf-1和p-ERK1/2的表达下调,从而发挥抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。此外,MRSP也具有促VSMCs凋亡的作用,该作用主要是通过抑制]Ras-PI3K-Akt信号通路而实现。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 携带Mfn2基因不同结构序列的重组腺病毒构建、扩增和纯化
• 参考文献
• 第二部分 Mfn2基因不同结构序列对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响
• 参考文献
• 第三部分 Mfn2基因相关合成肽对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 研究生期间发表的文章
• 致谢