运动发酵单胞菌乙醇发酵性能及絮凝机制

论文摘要

与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）乙醇发酵Embden-Meyerhof-Parnas （EMP）途径相比,运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）通过Entner-Doudoroff （ED）途径代谢葡萄糖生产乙醇,这一过程ATP生成减少50%,可能积累较少的生物量,进而增加乙醇对糖的表观收率。此外,Z. mobilis细胞小,比表面积大,更有利于糖的吸收,提高乙醇发酵过程的生产强度指标。因此,Z. mobilis有更强的研究和应用价值。本文首先在可比实验条件下研究了酿酒酵母和运动单胞菌的乙醇发酵性能来证实这些推测。与S. cerevisiae ADY相比,Z. mobilis ZM4发酵100g L-1低葡萄糖浓度培养基时,乙醇表观收率和生产强度分别提高了3.5%和58.1%,发酵200g L-1高葡萄糖浓度培养基时,乙醇表观收率提高为3.3%,没有明显变化,但乙醇生产强度的提高与培养基流加策略密切相关,在补料批式发酵条件下,其提高幅度高达77.8%。微生物细胞自絮凝不仅可以方便菌体沉降分离,而且这一明显的形态改变可能提高细胞的环境胁迫响应。本文进一步比较了运动单胞菌常规非絮凝菌株（ZM4）和自絮凝菌株（ZM401）。实验结果表明,Z. mobilis的自絮凝对乙醇发酵性能没有明显影响,但ZM4在10.5g L-1的乙酸添加培养基中发酵同样时间,乙醇表观收率比ZM401降低了29.9gL-1。在1.0g L-1的香草醛添加培养基中,相同时间下ZM401发酵产生的乙醇表观收率比ZM4高29g L-1,说明絮凝菌株ZM401对秸秆类生物质预处理过程产生主要副产物乙酸和香草醛的耐受性明显比游离菌株ZM4高。在此基础上,采用激光聚焦反射测量系统（Focused beam reflectance measurement, FBRM）对Z. mobilis絮凝过程进行了在线监测和表征,研究了影响这一过程的物理和化学因素,推测其自絮凝的物质基础可能是胞外多糖,特别是纤维素类多糖,并进一步通过将纤维素合成酶基因簇过表达来尝试构建絮凝菌株,得到了可以达到清液发酵的基因工程菌ZM401-CTF258-6,证实了纤维素合成酶对Z. mobilis形成自絮凝特征具有一定贡献,可以使原本具有絮凝特性的ZM401细胞絮凝形成的更加完全,但纤维素合成酶的过量表达并非ZM401菌株絮凝的根本原因,因为在非絮凝菌株ZM4中进行纤维素合成酶的过表达并不能赋予其絮凝特性。最后对自絮凝菌株ZM401基因组进行测序,并与非絮凝模式菌株ZM4基因组进行比较,发现了58个单核苷酸多态（SNPs）,其中28个SNPs在编码区,占48.3%,另外30个SNPs在非编码区,占51.7%,而且一个8bp的片段缺失存在于间隔序列,是假设蛋白ZMO1010重复序列的一部分。共线性分析显示ZM401和ZM4的基因组存在92个不同的变异核苷酸,为进一步揭示Z. mobilis自絮凝的分子机理奠定了基础。以上研究表明,与酿酒酵母相比,运动单胞菌,特别是自絮凝菌株,不仅乙醇发酵性能优良,而且具有较好的环境胁迫耐受性,是构建以秸秆为代表的木质纤维素类生物质为原料生产第二代燃料乙醇的良好出发菌株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 Z.mobilis乙醇发酵研究进展
• 1.1 燃料乙醇的开发和利用
• 1.2 纤维素乙醇混合糖发酵关键技术
• 1.3 乙醇发酵的EMP和ED代谢途径
• 1.4 醇发酵工艺
• 1.4.1 批式发酵
• 1.4.2 连续发酵
• 1.4.3 同步糖化发酵
• 1.5 Z.mobilis分子生物学研究
• 1.5.1 分子生物学研究瓶颈
• 1.5.2 分子生物学研究进展
• 1.6 细胞自絮凝现象及应用
• 1.6.1 固定化细胞技术
• 1.6.2 微生物自絮凝机理
• 1.6.3 环境胁迫耐受性
• 1.6.4 细胞絮凝的实际应用
• 1.7 比较基因组学研究
• 1.8 研究工作的目的意义及主要内容
• 1.8.1 目的及意义
• 1.8.2 主要内容
• 2 Z mobilis发酵特性与酵母的比较
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验菌种
• 2.2.2 主要试剂和培养基
• 2.2.3 主要仪器和设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 ZM4,ZM401和ADY的培养
• （1） 斜面培养
• （2） 摇瓶培养及发酵
• （3） 种子扩大培养及批次发酵
• （4） ZM4的分批补料发酵
• （5） ZM4和ZM401的玉米秸秆水解液发酵
• 2.3.2 发酵各参数分析方法
• （1） 葡萄糖、乙醇浓度的测定
• （2） 生物量的测定
• （3） 发酵主要副产物的分析方法
• 2.4 实验结果与分析
• 2.4.1 乙醇发酵性能
• 2.4.2 氧化还原电位
• 2.4.3 主要副产物生成
• 2.4.4 ZM401的乙醇发酵
• 2.4.5 Z. mobilis对抑制副产物的耐受性
• 2.5 小结
• 3 Z.mobilis的絮凝颗粒在线表征及影响因素
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂和仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 ZM4和ZM401的培养和发酵
• 3.3.2 影响ZM401絮凝的因素
• 3.3.3 ZM401絮凝颗粒的粒径测定
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 ZM4与ZM401的发酵颗粒在线表征
• 3.4.2 影响ZM401絮凝颗粒的因素分析
• 3.4.3 影响ZM401絮凝形成的因素分析
• 3.4.4 ZM401的絮凝特征
• 3.5 小结
• 4 Z mobilis ZM401絮凝物质及相关基因转录水平比较
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验菌种及质粒
• 4.2.2 试剂和培养基
• 4.2.3 主要仪器和设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 发酵方式
• 4.3.2 ZM4和ZM401菌体形态的观察
• 4.3.3 ZM401菌体的酶法解絮及重絮凝
• 4.3.4 ZM4和ZM401絮凝颗粒表征及转录水平检测样品
• 4.3.5 ZM4和ZM401纤维素合成酶基因转录水平的检测
• 4.3.6 运动发酵单胞菌中表达载体的构建
• 4.4 实验结果与分析
• 4.4.1 ZM4和ZM401菌体形态对比
• （1） ZM4和ZM401菌体光镜下形态的比较
• （2） ZM4和ZM401菌体染色后显微镜下形态的比较
• （3） ZM4和ZM401菌体电镜下形态的比较
• 4.4.2 ZM401酶解过程中的观察及形态比较
• （1） ZM401纤维素酶水解过程中的形态变化
• （2） 几种酶水解ZM401絮凝颗粒后的形态
• （3） ZM401纤维素酶水解后重絮凝的形态
• （4） ZM401和ZM4胞外絮凝物质的红外光谱图
• 4.4.3 ZM401纤维素合成酶基因转录水平的分析
• （1） ZM4和ZM401菌体总RNA
• （2） ZM4和ZM401纤维素合成酶基因转录水平的比较
• （3） ZM401和ZM4中纤维素合成酶基因的过表达
• 4.5 小结
• 5 Z mobilisZM401的全基因组测序及与ZM4的比对分析
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与仪器
• 5.2.1 实验菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 主要试剂和仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 ZM401基因组的提取
• 5.3.2 ZM401基因组的测序
• 5.3.3 ZM401基因组测序信息的分析
• 5.3.4 ZM401基因组测序结果的拼接
• 5.3.5 ZM401与ZM4基因组差异比对
• （1） ZM401基因组SNP的检测
• （2） ZM401基因组InDel的检测
• （3） ZM401基因组共线性的分析
• 5.4 实验结果与分析
• 5.4.1 ZM401的基因组数据组装分析
• 5.4.2 ZM401的基因预测
• 5.4.3 ZM401的基因功能注释
• 5.4.4 ZM401的变异分析
• 5.5 小结
• 结论
• 后续研究工作展望
• 创新点摘要
• 参考文献
• 附录A 表达载体序列及酶切位点
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢
• 作者简介