鲤鱼小清蛋白的抗原性研究

论文摘要

鱼类食物是人类获取优质蛋白的重要途径,但有部分人对鱼类蛋白过敏,健康受到极大威胁。有研究表明,鲤鱼和鳕鱼等鱼类中主要过敏原是小清蛋白,因而研究鲤鱼小清蛋白的抗原性将有助于预防食物过敏和生产低致敏性产品。本研究的主要内容包括鲤鱼小清蛋白的分离纯化,兔抗鲤鱼小清蛋白多克隆抗体的制备及青鱼、草鱼、鲢鱼蛋白的粗提物与鲤鱼小清蛋白之间免疫交叉反应的研究。通过实验,建立了以磷酸盐缓冲液粗提结合DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化鲤鱼小清蛋白的方法;SDS-PAGE和PAGE鉴定结果表明,用这种方法可以获得纯度＞90%的鲤鱼小清蛋白样品。本实验建立了间接ELISA检测兔抗鲤鱼小清蛋白抗血清效价的检测方法及制备兔抗鲤鱼小清蛋白多克隆抗体的方法。免疫两只日本雄性大白兔分别获得了间接ELISA检测效价高达1:560,000和1:720,000的抗血清。结合间接竞争ELISA实验对鲤鱼小清蛋白的抗原性进行了分析和评价,研究结果表明,鲤鱼小清蛋白具有很好的抗原性。通过免疫印迹和间接竞争ELISA实验,证实了鲤鱼小清蛋白和青鱼、草鱼、鲢鱼粗提蛋白之间存在免疫交叉反应,发生交叉反应的主要蛋白分子量约为12kDa。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 食物过敏
• 1.2.1 食物过敏反应的免疫学机制
• 1.2.2 食物过敏原
• 1.3 淡水鱼类过敏
• 1.3.1 鲤鱼、青鱼、草鱼、鲢鱼简介
• 1.3.2 淡水鱼类过敏
• 1.3.3 鲤鱼小清蛋白
• 1.4 抗原性及免疫交叉反应性
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 第2章 鲤鱼小清蛋白的分离纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与设备
• 2.2.1 试剂与材料
• 2.2.2 主要设备
• 2.2.3 溶液的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 鲤鱼肌肉的预处理
• 2.3.2 鲤鱼蛋白的粗提
• 2.3.3 煮沸除杂蛋白
• 2.3.4 硫酸铵沉淀
• 2.3.5 离子交换层析法提取鲤鱼小清蛋白
• 2.3.6 SDS-PAGE电泳分析
• 2.3.7 PAGE电泳分析
• 2.3.8 蛋白浓度的测定
• 2.4 结果
• 2.4.1 预处理的效果
• 2.4.2 离子交换层析结果
• 2.4.3 电泳鉴定纯度
• 2.4.4 蛋白质含量变化
• 2.5 讨论
• 2.5.1 预处理过程对离子交换层析的影响
• 2.5.2 离子交换层析条件的选择
• 2.5.3 蛋白纯度鉴定方法的可行性
• 2.6 本章小结
• 第3章 鲤鱼小清蛋白抗原性的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器与耗材
• 3.2.3 溶液配制
• 3.3 方法
• 3.3.1 试验动物
• 3.3.2 抗原的准备
• 3.3.3 免疫方案
• 3.3.4 血清的分离
• 3.3.5 建立检测抗体效价的间接ELISA方法
• 3.3.6 间接ELISA测抗体效价
• 3.3.7 建立间接竞争ELISA检测抗体特异性的方法
• 3.3.8 间接竞争ELISA法检测抗体特异性
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 抗血清效价间接ELISA检测方法的建立
• 3.4.2 免疫过程中抗体效价的变化
• 3.4.3 间接竞争ELISA检测抗体特异性方法的建立
• 3.5 讨论
• 3.5.1 多克隆抗体的制备
• 3.5.2 抗体效价的检测方法
• 3.5.3 兔对鲤鱼小清蛋白的免疫应答
• 3.5.4 抗体特异性
• 3.6 本章小结
• 第4章 免疫交叉反应的研究
• 4.1 引言
• 4.2 仪器与试剂
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 仪器与耗材
• 4.3 方法
• 4.3.1 草鱼、青鱼、鲢鱼蛋白的粗提
• 4.3.2 免疫印迹法研究免疫交叉反应
• 4.3.3 间接竞争ELISA法研究免疫交叉反应
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 青鱼、草鱼、鲢鱼蛋白粗提物的含量
• 4.4.2 免疫印迹的结果
• 4.4.3 间接竞争ELISA的结果
• 4.5 讨论
• 4.5.1 青鱼、草鱼、鲢鱼蛋白的粗提
• 4.5.2 免疫印迹中蛋白质转移的问题
• 4.5.3 免疫印迹的背景与信号问题
• 4.5.4 关于竞争抑制ELISA
• 4.5.5 淡水鱼类过敏原交叉反应
• 4.6 本章小结
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 硕士期间成果