论文摘要
研究背景当前,随着社会经济的发展及人民生活水平的提高,糖尿病（Diabetes Mellitus）已成为威胁人类生命健康的重要疾病。在糖尿病中,又以2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus）为主,目前我国20岁以上糖尿病患者人数已达9 240万,成为全世界糖尿病患者人数最多的国家。糖尿病的危害主要在于其严重的并发症,包括心脑血管疾病、视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病足等,其中心脏合并症是糖尿病患者死亡的主要原因。虽然关于糖尿病心脏并发症的发生机理已有大量研究,但主要集中在冠脉血管损伤以及炎症反应的影响,对心肌细胞直接的损伤研究仍然较少。硫氧还蛋白（Thioredoxin, Trx）系统是体内重要的氧化还原蛋白系统,广泛表达于各种细胞,在很多有自由基损伤和凋亡发生的疾病如炎症,肿瘤,再灌注损伤等的发生、发展中均发挥重要作用。糖尿病时表现显著的糖、脂代谢异常,有大量自由基产生,而Trx系统是体内重要的抗自由基损伤物质,因此我们推测Trx系统可能参与了糖尿病时各种损伤的发生。我们前期使用在体动物的研究表明,在2型糖尿病模型大鼠中,有心肌损伤和心肌细胞凋亡发生,同时糖尿病可通过抑制硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin Reductase,TR）的活性、增加硫氧还蛋白相互作用蛋白（Trx interacting protein,TXNIP;又名硫氧还蛋白结合蛋白—Trx binding protein-2,TBP2;或维生素D3上调蛋白-1—Vitamine D3 upregulated protein-1,VDUP-1）的表达而抑制Trx活性,在模型早期甚至可以直接减少Trx表达而抑制心肌Trx功能,从而削弱Trx的抗凋亡作用而诱导心肌细胞凋亡。糖尿病引起心肌细胞损伤的原因可能有很多,髙糖高脂刺激、中性粒细胞等炎症细胞产生的TNF-α等炎性介质、冠脉血管的损伤等均有可能参与糖尿病心脏损伤的发生。为明确糖尿病时体内高糖高脂是否对心肌细胞有直接损伤作用,以及心肌细胞本身的Trx系统是否发生变化并介导高糖高脂的损伤,使用培养的心肌细胞进行研究就成为必然的选择。虽然在培养乳鼠心肌细胞中发现,高糖、高脂刺激可以引起心肌细胞损伤,但是乳鼠心肌细胞呈梭形,生长旺盛,其结构、对外界刺激的反应和抵抗力等与成熟细胞有较大差别。因此,在本研究中,我们建立了成年大鼠心肌细胞的分离与培养模型,在此基础上给予高糖、高脂刺激模拟2型糖尿病,并运用LDH活性测定,caspase活性检测技术观察给予高糖高脂刺激后心肌细胞损伤及凋亡发生情况;运用胰岛素还原法检测Trx活性及TR活性改变;运用Real-time PCR,Western Blot等方法测定给予高糖高脂刺激后培养的心肌细胞中Trx系统成员及TXNIP的表达情况,从而进一步探讨Trx系统和TXNIP在高糖高脂培养的成年大鼠心肌细胞凋亡中的作用。目的1.建立成年大鼠心肌细胞培养模型,观察给予高糖高脂刺激是否可以引起心肌细胞凋亡,并了解其损伤和凋亡程度;2.了解高糖高脂培养造成的心肌细胞损伤中硫氧还蛋白系统主要成员活性和表达的变化,并分析其与心肌细胞凋亡之间的关系;3.了解高糖高脂培养引起心肌细胞凋亡时,TXNIP是否发生变化,并分析其与心肌细胞凋亡的关系。方法1.成年大鼠心肌细胞的分离与培养以及实验分组选取体重约250 g的雄性成年SD大鼠,肝素化并麻醉后,迅速开胸取出心脏,经主动脉插管固定在Langendorff离体心脏灌流装置上,灌流洗净残血后用酶液消化至心脏呈毛玻璃状,取下并置于stop液中剪碎并吹打使细胞分散,过滤所得细胞悬液梯度钙化。最后将细胞悬液用培养基调至适当浓度后接种至35mm培养皿中,随机分为两组:正常对照组:使用含葡萄糖5 mmol/L的常规M199培养基加入甘露醇20 mmol/L作为对照培养基进行培养;高糖高脂组:使用含有葡萄糖25 mmol/L、软脂酸600μmol/L的M199培养基作为高糖高脂培养基进行培养。两组细胞均于37 oC,5% CO2细胞培养箱中培养48 h后收集培养基上清与培养细胞待测。2.指标检测测定培养基上清中乳酸脱氢酶（LDH）活性反映心肌细胞坏死情况,测定心肌细胞caspase-3活性反映心肌细胞的凋亡程度,测定caspase-8和caspase-9活性分析心肌细胞的凋亡途径,以胰岛素还原法测定心肌细胞中Trx活性和TR活性,以Real-time PCR法测定心肌细胞Trx1、Trx2、TR1、TR2和TXNIP的mRNA水平,以Western Blot法测定心肌细胞Trx1、Trx2、TR1、TR2和TXNIP的蛋白表达。结果1.成年大鼠心肌细胞培养48h后形态学观察培养的成年大鼠心肌细胞呈杆状,细胞内可见明显的肌原纤维结构,而培养的乳鼠心肌细胞则呈三角形或梭形,故成鼠心肌细胞与乳鼠的相比,更接近成年在体情况,在科研上具有更高的价值。由图1可见:在培养48h后,正常对照组细胞密度较大,绝大多数心肌细胞形态结构完整,边缘清晰;而高糖高脂组则有部分心肌细胞短缩,细胞横纹结构模糊,且死亡的圆形细胞比例增多。2.乳酸脱氢酶活性测定正常对照组乳酸脱氢酶活性为（715.2±128.2） U/L,高糖高脂组乳酸脱氢酶活性为（1054.6±122.9） U/L,与正常对照组相比明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。该结果表明培养的成年大鼠心肌细胞膜发生了损伤,乳酸脱氢酶大量漏出,有坏死性的心肌细胞损伤参与。3.凋亡增加3.1 Caspase-3活性分析经检测,培养48h后,与正常对照组成年大鼠心肌细胞相比,高糖高脂组心肌细胞caspase-3活性显著升高,差异具有统计学意义[（0.0829±0.0115） nmol·h-1·mg-1pro. vs. （0.0543±0.0118） nmol·h-1·mg-1pro., P<0.01)]（图2）。3.2 Caspase-8和Caspase-9活性分析经检测,培养48h后,与正常对照组成年大鼠心肌细胞相比,高糖高脂组心肌细胞caspase-8活性和caspase-9活性均显著升高[caspase-8活性: （0.1991±0.0334） nmol·h-1·mg-1pro. vs. （0.1446±0.0279） nmol·h-1·mg-1pro.; caspase-9活性:（0.1036±0.0146） nmol·h-1·mg-1pro. vs. （0.0653±0.0170） nmol·h-1·mg-1pro., P均<0.01] （图2）。4.高糖高脂组成年大鼠心肌细胞Trx系统活性降低4.1高糖高脂组成年大鼠心肌细胞Trx活性降低经检测,培养48h后,高糖高脂组成年大鼠心肌细胞与正常对照组心肌细胞相比,其Trx相对活性显著降低（0.24±0.17 vs. 1.00±0.37, P<0.01）（图3）。4.2高糖高脂组成年大鼠心肌细胞TR活性降低经检测,培养48h后,高糖高脂组成年大鼠心肌细胞与正常对照组心肌细胞相比,其TR相对活性显著降低（0.60±0.22 vs. 1.00±0.28, P<0.01） （图4）。5.培养48h后成年大鼠心肌细胞Trx系统mRNA水平和蛋白表达变化5.1培养的成年大鼠心肌细胞Trx系统mRNA水平变化培养48h后,与正常对照组心肌细胞相比,高糖高脂组成年大鼠心肌细胞Trx1、Trx2mRNA水平未见明显改变;而TR1和TR2 mRNA水平下降,差异具有显著性（Trx1: 1.052±0.189 vs. 1.000±0.000, P>0.05; Trx2: 0.999±0.258 vs.1.000±0.000, P>0.05; TR1: 0.862±0.126 vs. 1.000±0.000, P<0.05; TR2: 0.803±0.174 vs. 1.000±0.000, P<0.05） （图7,10）。5.2培养的成年大鼠心肌细胞Trx系统蛋白表达变化培养48h后,与正常对照组心肌细胞相比,高糖高脂组成年大鼠心肌细胞Trx1和Trx2蛋白表达未见明显差异;而TR1和TR2蛋白表达明显降低,差异均具有显著性（Trx1:0.74±0.26 vs. 1.00±0.44, P>0.05; Trx2:0.68±0.21 vs. 1.00±0.37, P>0.05; TR1: 0.55±0.19 vs. 1.00±0.40, P<0.05; TR2: 0.49±0.20 vs. 1.00±0.55, P<0.05） （图11,12,13,14）。6.培养48h后成年大鼠心肌细胞TXNIP mRNA水平和蛋白表达变化6.1培养的成年大鼠心肌细胞TXNIP mRNA水平变化培养48h,与正常对照组大鼠心肌细胞相比,高糖高脂组成年大鼠心肌细胞TXNIP mRNA水平显著升高（1.418±0.302 vs. 1.000±0.000, P<0.01） （图17）。6.2培养的成年大鼠心肌细胞TXNIP蛋白表达变化培养48h后,与正常对照组大鼠心肌细胞相比,高糖高脂组成年大鼠心肌细胞TXNIP蛋白表达显著升高（1.63±0.57 vs. 1.00±0.13, P<0.05） （图18）。结论1.高糖高脂刺激可以引起培养的成年大鼠心肌细胞发生损伤和凋亡,在此凋亡中同时有caspase-8和caspase-9依赖的凋亡途径参与?2.高糖高脂刺激可以降低培养的成年大鼠心肌细胞Trx活性,从而削弱其抗凋亡作用而诱导心肌细胞凋亡。3.高糖高脂对Trx的抑制作用与其降低心肌细胞TR活性、增加TXNIP的表达有关。