论文摘要
从冬凌草中提取的萜类化合物冬凌草甲素（oridonin, ORI）能抑制多种肿瘤细胞增殖,并诱导其发生凋亡,但机制尚未阐明。近年文献报道ORI是目前在临床上广泛应用于前列腺癌治疗的PC-SPES方剂的重要活性化合物之一,本实验研究ORI处理后前列腺癌细胞的形态学及分子生物学改变,旨在探讨其抗前列腺癌的机制。我们应用体外培养前列腺癌激素非依赖型PC-3、DUl45细胞及激素依赖型LNCAP细胞,通过CCK-8试剂盒检测,发现ORI能有效抑制上述三株细胞株增殖,并呈现显著的剂量和时间依赖性。在ORI作用细胞24 h后,应用DAPI荧光染色,未观察到DNA断裂现象；在透射电镜下观察,细胞核形态正常,但胞浆中出现大量由双层膜包裹的自噬体及自噬前体,自噬体内含部分胞质、线粒体或高尔基体等细胞器；通过Acridine orange （AO）及Mono-dansylcadervarine （MDC）活细胞染色发现胞浆中存在大量酸性泡囊细胞器（acid vesicular organelles, AVOs.）。在PC-3细胞转染tfLC3质粒后,共聚焦显微镜下观察到ORI诱导LC3Ⅱ在自噬体膜上募集。Western blot检测发现ORⅠ处理导致LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ的泛素化修饰。自噬特异性抑制剂3-MA能抑制ORI引l起的AVOs形成及LC3I蛋白的泛素化修饰。ORI上调P21蛋白表达水平,但抑制自噬能完全逆转P21蛋白水平的增加。在ORI作用48h细胞后,细胞核出现DNA断裂,染色质凝集及细胞表面微绒毛消失,以及自噬体和AVOs。应用Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞术检测到ORI作用的PC-3及LNCaP细胞凋亡率明显提高。本研究表明,ORI作用诱导前列腺癌细胞发生自噬及凋亡,且自噬能被3-MA抑制。MAP-LC3蛋白参与调控自噬体成熟过程,P21蛋白高表达与ORI诱导的自噬呈正相关。我们的实验结果为ORI在临床上应用于前列腺癌的治疗提供实验依据,为ORI抗肿瘤机制研究提供新的思路。
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