论文摘要
【研究背景与目的】卵巢恶性肿瘤是妇科三大恶性肿瘤之一,发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第三位,因缺乏特异性症状及有效的早期诊断手段,多数患者确诊时已为晚期。卵巢恶性肿瘤易转移及广泛播散,易复发,预后差,5年生存率仅30%左右,死亡率居妇科恶性肿瘤的首位。关于卵巢癌发生发展的机制也有较多研究探讨,但目前还未有明确的解释。近年来,随着干细胞的研究进展,人们发现肿瘤细胞与干细胞有较多相似性,因而提出了“肿瘤干细胞”的假说。此假说认为:肿瘤的发生、发展及复发归因于肿瘤组织内存在具有无限增殖能力的肿瘤干细胞,而肿瘤干细胞有可能来自于干细胞的突变或融合。随着肿瘤干细胞假说的提出,人们发现许多肿瘤组织中都存在这样一群数目稀少的具有干细胞特点的细胞,这些细胞可以在免疫缺陷的小鼠体内形成完整的肿瘤组织,被称为边缘（sidepopulation,SP）细胞。在几株卵巢癌细胞系中也发现了这种细胞。肿瘤干细胞假说的提出为肿瘤的发生机制探讨及治疗学的研究提出了新的思路,从干细胞的角度来研究探讨肿瘤的各种生物学行为等,使肿瘤细胞的重塑成为可能。干细胞治疗是当今研究的热点,其中首推全能干细胞。全能干细胞是目前所知的最具有多向分化潜能的干细胞,包括胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞等。由于其特殊的生物学特性,使其在细胞治疗、组织修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景,成为21世纪生物医学的热点。全能干细胞的自我更新及多向分化的潜能,在多种信号通路的调节下维持在稳定的正常的平衡状态。因而,我们猜测这种具有正常发展模式的全能干细胞是否能使肿瘤细胞的生长得到控制?全能干细胞在肿瘤研究领域的应用,多是先对其进行诱导分化,再支持进一步治疗,而这种直接研究的报道较少。但已有报道鼠胚胎干细胞可以在体外抑制胰腺癌细胞的生长。近年来又有研究表明人胚胎干细胞可以逆转黑色素瘤细胞的恶性行为。胚胎生殖干细胞是全能干细胞的一种,来源于胎儿生殖嵴的原始生殖细胞,在生物学行为上与来自内细胞团的胚胎干细胞相似,且取材方便,目前还未有其可形成畸胎瘤的报道。因而,我们通过体外共培养和体内动物模型,设计研究了人胚胎生殖干细胞对卵巢癌细胞生长的作用。第一部分人胚胎生殖干细胞的分离、培养与鉴定【研究目的】从废弃流产胎儿的生殖嵴分离原始生殖细胞,培养并使其转化为人胚胎生殖干细胞,并为后续实验奠定基础。【研究方法】1、取孕13.5天小鼠的胎鼠背部皮肤,分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,制备小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）饲养层。2、取5-7周废弃的流产胎儿的生殖嵴及其周围组织,分离出人原始生殖细胞（human primary germ cells,hPGCs）。经体外分化抑制培养,获得由hPGCs转化成的人胚胎生殖干细胞（human embryonic germ cells,hEGCs）,并在体外增殖传代,简单比较胰酶消化传代法与胶原酶+机械法消化传代法的差别,初步观察探讨人白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）的作用。3、取不同代数的部分hEGCs克隆,检测其碱性磷酸酶活性、胚胎阶段特异性抗原（stage-specific embryonic antigen,SSEA）-1、3、4及TRA-1-60、TRA-1-81、OCT-4的表达,并对体外自发分化进行初步的观察,以鉴定该细胞。【结果】1、分离并纯化培养了小鼠胚胎成纤维细胞,取其3-5代制备MEF饲养层备用。2、将消化后的5-7周流产胎儿的生殖嵴接种于MEF饲养层上,培养2天后就出现了较明显的细胞团。经过体外抑制培养,hEGCs可以传至第11代。在传代中发现胶原酶+机械法更适合hEGCs的传代生长。在培养中发现去除LIF对细胞体外分化抑制培养无明显的影响。3、免疫组化及免疫荧光显示培养的细胞具有较高的碱性磷酸酶活性,并表达SSEA-1、3、4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4。符合文献报道的hEGCs的特征。撤去条件培养液后,hEGCs在体外自发分化为神经球样结构及具有自动收缩节律的心肌样细胞。【结论】成功从废弃流产胎儿的生殖嵴及其周围组织中分离出hPGCs,并经体外分化抑制培养,获得由hPGCs转化成的hEGCs。经初步鉴定该细胞符合hEGCs的特征,为后续实验奠定了基础。第二部分人胚胎生殖干细胞在体内外对人卵巢癌细胞SKOV3生长的作用研究【研究目的】通过体外共培养研究人胚胎生殖干细胞对人卵巢癌细胞SKOV3生长的作用,并进行初步的机制探讨。利用SCID小鼠建立卵巢癌的动物模型,初步研究hEGCs在体内对卵巢癌生长的作用。【研究方法】一、体外实验1、实验分两组,实验组将两种细胞先后接种在六孔板中共培养,对照组只接种SKOV3细胞,共培养期间两组的培养液相同。共培养48h后,通过HE染色比较两组SKOV3细胞生长的情况,并通过细胞计数统计两组SKOV3细胞的生长变化。2、通过免疫组化的方法检测两组SKOV3细胞的tunel和caspase-9的表达情况,以观察细胞凋亡的变化。3、通过western blot检测两组SKOV3细胞的AKT和p-AKT蛋白的表达;并通过realtime RT-PCR检测两组SKOV3细胞的akt mRNA的表达情况,并比较其差异。二、体内实验1、将40只小鼠随机分成两组,利用SKOV3卵巢癌细胞在SCID小鼠皮下建立人卵巢癌的动物模型。2、在小鼠皮下出现可触到的瘤块时（约在接种后7天,瘤块直径约0.5cm）,实验组将培养的一代或二代人胚胎生殖干细胞（约2×105/0.1mlPBS）注入肿瘤组织内,对照组仅注射0.1mlPBS,观察并比较两组动物的肿瘤生长情况。3、在14天、24天、35天时分别处死两组部分小鼠,将肿瘤组织固定做石蜡切片,进行tunel凋亡检测。【结果】一、体外实验1、共培养48h后,HE染色显示实验组SKOV3细胞的分布较对照组稀疏,且越靠近hEGCs克隆周围的SKOV3细胞越稀疏。细胞计数显示,共培养48h后,实验组SKOV3细胞计数为（7.8±2.4）×104,明显少于对照组（11.5±2.3）×104。2、实验组tunel染色的阳性信号明显多于对照组,且阳性信号大多聚集于干细胞克隆周围。caspase-9染色的结果与tunel染色相似的,实验组的阳性信号也多于对照组。3、western blot显示实验组p-AKT蛋白的表达明显弱于对照组,AKT蛋白表达无明显差异。realtime RT-PCR显示实验组akt mRNA的表达都少于对照组,尤以akt2 mRNA最为明显。二、体内实验1、同期观察测量发现实验组动物的肿瘤生长慢于对照组。2、Tunel凋亡染色发现,同期肿瘤组织中实验组的凋亡信号多于对照组,且随时间延长实验组凋亡信号分布逐渐弥散增多。【结论】HEGCs可以在体外共培养中抑制SKOV3细胞生长。其机制可能是通过降调p-AKT和akt mRNA的表达,激活caspase-9,诱导SKOV3细胞的凋亡。体内初步实验发现hEGCs也可以抑制卵巢癌的生长,此作用可能是通过诱导了癌细胞的凋亡引起的。第三部分微流控芯片技术在体外共培养hEGCs和SKOV3细胞中的应用【研究目的】利用微流控芯片技术共培养hEGCs和SKOV3细胞,并与孔板共培养方法进行比较。【研究方法】1、根据实验要求设计微流控芯片的模型,根据常规的步骤制备微流控芯片,消毒灭菌备用。2、实验组将hEGCs和SKOV3细胞分别接种于微流控芯片中不同的培养槽中,对照组只接种SKOV3细胞于相应的培养槽中,共培养48h,保持培养液的单向流动。3、共培养期间利用显微镜实时观察并记录实验组与对照组SKOV3细胞的生长情况。4、共培养结束后,检测两组SKOV3细胞的tunel的表达情况。5、用孔板共培养作为平行对照,比较两种培养方法。【结果】1、设计并制备了实验所需的微流控芯片,并达到细胞培养的要求。栅栏结构的设计使培养液可以缓慢单向的流动,在12h后在进液孔与出液孔之间达到平衡。2、在微流控芯片中,我们可以实时观察到SKOV3细胞的生长情况,并可以直观的比较实验组与对照组SKOV3细胞生长的差异。实验组SKOV3细胞生长变化较小,而对照组可以看到明显的SKOV3细胞的生长增殖,通过测量SKOV3细胞生长的外缘距出液孔外缘的距离可以比较两组的差别。3、微流控芯片中的SKOV3细胞的tunel结果显示实验组的凋亡信号多于对照组。实验组的凋亡信号沿着液流方向逐渐减少。4、将微流控芯片共培养与孔板共培养比较,发现微流控芯片具有较多的优点,例如可以直观实时地观察细胞的生长变化,可以控制培养液的流向和流速,可以控制微环境的变化等。【结论】微流控芯片技术优于传统的共培养模式:1)微流控芯片技术可以把两种贴壁细胞分离开来共培养;2)可以实时监控细胞生长变化,便于比较。3)可以控制液流的方向,研究单向的作用;4)设计方便,花费较小。微流控芯片更适合于共培养和研究细胞之间的作用。通过分泌细胞因子来抑制SKOV3细胞的生长有可能是hEGCs作用的途径之一。