论文摘要
家蚕是重要经济文化昆虫、鳞翅目模式昆虫和理想的昆虫“生物工厂”。自2003年家蚕全基因组序列测定以来,国内外围绕蚕丝蛋白合成、变态发育和分子免疫等家蚕重要经济及生物学性状,迅即展开全面深入的基因鉴定与功能研究并取得了重要进展,尤其针对蚕的生长发育和变态这一昆虫重大科学问题,已取得了包括基因和蛋白质鉴定、重要基因的功能验证以及性状形成机理的初步解析等丰富成果,为彻底阐释蚕的生长发育与变态机制奠定了坚实基础。脂肪体是蚕的营养与能量储存及供给中心,是体内激素（如蜕皮激素和保幼激素等）作用的靶组织,在蚕的生长发育和变态过程中扮演着关键角色。目前认为,昆虫的蜕皮与变态发育进程受蜕皮激素控制,昆虫发育的方向则受保幼激素调控。在家蚕中已经发现,许多在家蚕脂肪体特异表达的基因均在转录水平受到激素的精确调控,随蚕的发育呈规律性的表达变化。因而,研究家蚕脂肪体表达基因及其功能与调控,对于阐释昆虫（家蚕）受激素调控的生长发育与变态分子机理具有重要意义。不仅如此,蚕的脂肪体非常发达,特别在5龄幼虫中后期至化蛹这段时间内,脂肪体约占体重的30%。按一头蚕（5龄盛食期）平均体重为5g计算,其脂肪体蛋白含量最高可达到1.5g左右,如利用其生产外源蛋白,有望成为继丝腺之后又一具重大开发潜力的新型昆虫生物反应器。尽管有关家蚕脂肪体及相关基因的研究已取得丰富积累,但总的来看,目前尚待解决的问题还很多。特别是脂肪体表达基因启动子的鉴定与功能研究,至今仍鲜有涉及,这也在一定程度上制约了相关基因的功能与调控机理研究。为此,本文以家蚕脂肪体特异表达基因BmLSP（1-4龄幼虫期特异表达）和BmLP3（5龄幼虫后期至化蛹阶段特异表达）为目标,在克隆该两个启动子的基础上,以BmLP3启动子为重点,首先,在细胞水平对BmLP3启动子的核心元件进行鉴定与功能分析；其次,利用转基因技术在个体水平分别对BmLP3和BmLSP启动子进行活性和特异性检测;第三,探索利用BmLP3启动子开发家蚕脂肪体生物反应器。获得的主要结果如下：1 BmLSP和BmLP3启动子的生物信息学鉴定与克隆基于家蚕全基因组序列和基因芯片数据,鉴定并克隆了BmLSP和BmLP3启动子序列：1)BmLSP启动子序列长度为1660 bp,含有BmLSP基因的第1外显子、第1内含子、核心启动区域和5′旁侧区,与家蚕品种苏菊×明虎的LSP启动子区相比,在第1内含子区的+341位置插入了一个263 bp的mariner-like转座子序列,BmLSP启动子区存在与果蝇HSP23蜕皮激素应答元件和脂肪体特异转录基序高度同源的调控序列；2)BmLP3启动子序列长度1119bp,该序列含有BmLP3基因的第1外显子、第1内含子、第2外显子的一部分、核心启动区域和5′旁侧区,是未曾报道的序列。该序列存在典型的TATA框、一个Sp1蛋白结合的共有序列、一个Bm1元件等,暗示这些序列在BmLP3基因的表达中可能作为顺式作用元件发挥其调控作用。2 BmLSP启动子驱动DsRed在转基因家蚕中的表达分析家蚕幼虫血清蛋白（larval serum protein, BmLSP）是由脂肪体细胞合成的一种贮藏蛋白,是研究家蚕幼虫期发育调控的理想靶标。本实验以piggyBac转座子为介导,通过转基因的方法研究了BmLSP启动子在个体水平的活性及特异性。以携带有3xP3-EGFP荧光筛选标记的piggyBac骨架载体为基础,红色荧光蛋白DsRed为报告基因,构建成pBac[BmLSP-DsRed-SV40]表达载体并显微注射家蚕P50早期胚胎,获得了转基因品系。分子检测结果表明：BmLSP-DsRed表达框以单拷贝形式整合至家蚕基因组；DsRed在转基因家蚕脂肪体中特异转录表达,其时期表达特征与BmLSP基因基本一致,随发育阶段的不同呈现有规律的变化,即幼虫期表达,但1龄、2龄眠期不表达,3龄、4龄眠期有微弱表达,上蔟后表达量逐渐降低直至化蛾阶段消失。提示BmLSP可能通过其启动子区的特异元件受激素的精确调控而行使功能。3 BmLP3启动子核心元件的细胞水平鉴定与分析首先,对BmLP3全长启动子进行了5′端分段顺次缺失,得到7种不同长度的BmLP3启动子序列,将其分别克隆至pGL3-basic载体构建成细胞转染载体Luc-F1～Luc-F7,转染家蚕胚胎细胞系BmE并通过测定相应的Luc酶活以鉴定启动子的核心元件。结果表明：BmLP3启动子转录起始点上游-250bp～-151 bp区域参与增强了Luc的转录表达。将此段区域分别制成标记探针Probe 1和Probe 2,与家蚕5龄7天脂肪体的核抽提物进行EMSA实验,发现Probe 1与核抽提物具有特异性结合。为进一步弄清Probe 1中与核蛋白结合的具体位置,将Probe 1进行三段不同位置的缺失（Probe 1-1、Probe 1-2、Probe 1-3）后进行EMSA实验,结果显示探针Probe 1-1与核抽提物形成了明显的结合,而Probe 1-2和Probe 1-3的结合信号非常弱,说明与核蛋白结合的核心位点位于Probe 1-1中长度为21bp的序列（5’ AAATATACCTTTCACATGGCA 3’）,即位于-250～-230区域。为进一步验证该21bp序列的功能,将其克隆到BmLP3的核心启动子区上游,即转录起始位点前50bp的5′端,转染BmE细胞系并检测Luc的酶活发现,与对照Luc-F6相比,Luc的酶活提高了3.1倍,表明这21bp在细胞水平上有增强BmLP3启动子转录的作用。4 BmLP3启动子驱动DsRed在转基因家蚕中的表达分析为检测BmLP3启动子（长度为1119bp）在个体水平的活性,以红色荧光蛋白DsRed为报告基因,构建成以3xP3-EGFP为荧光筛选标记的pBac[BmLP3-DsRed-SV40]表达载体,经注射筛选获得了BmLP3-Red转基因蚕。分子检测和荧光观察结果表明：1) BmLP3-DsRed表达框以单拷贝整合至家蚕基因组,插入位点位于第20号染色体；DsRed在转基因家蚕脂肪体中高量转录表达,且自幼虫5龄4天开始,在5龄5天达到较高水平,之后表达水平持续上升,在化蛹前后达到最高,蛹形成后表达量逐渐下降,至蛹7天时完全消失。其表达特征与内源BmLP3基因基本一致。Western检测结果证实,DsRed蛋白仅在脂肪体中特异合成；将样品脂肪体的Western blot杂交信号与标准品进行灰度比对粗略估算,每10μg转基因蚕的脂肪体中约有0.54μg重组DsRed蛋白。2)对阳性个体于胚胎发育后期进行连续的荧光观察,发现在5龄4天幼虫时观察到蚕体后部开始发出红色荧光,随着家蚕的发育,到5龄7天幼虫时可观察到整个蚕体都发出了明亮的红色荧光。取转基因蚕的不同组织进行荧光观察,结果仅在脂肪体中有红色荧光信号发出,其它组织如丝腺、中肠、血液和生殖腺中无荧光信号；化蛹之后,整个蛹体亦有明亮的红色荧光信号。对多个转基因阳性个体进行观察发现红色荧光蛋白在雌雄个体中均有表达；不同个体间的表达水平有一定的差异,这种差异出现在不同转基因系的个体中,也会出现在同一个单拷贝个体回交的后代中。5 BmLP3启动子驱动phyA在转基因家蚕中的表达分析为进一步探索利用BmLP3启动子开发家蚕脂肪体生物反应器的可行性,以在饲料添加剂工业上具有重要应用价值的植酸酶（phyA）基因为靶标,构建成转基因表达载体pBac[BmLP3-phyA-SV40,3xP3EGFP],以实用蚕品种“7532”为受体,经显微注射筛选获得了BmLP3启动子驱动植酸酶表达的转基因蚕。分子检测结果表明：植酸酶基因已成功插入至家蚕基因组并有转录表达。取化蛹后2天的转基因蚕蛹总蛋白,以提取自小麦的植酸酶标准品为阳性对照,分别在pH值5.5、温度为0℃、37℃和55℃的条件下,采用国标法（GB/T18634-2009）测定重组植酸酶的酶活,结果显示：重组植酸酶具有生物活性,在0℃～55℃间,其活性随着温度的升高逐渐增强,55℃时酶活达到5.1U/g,提示此温度条件是保持重组植酸酶酶活的最适温度。本研究初步证实,利用家蚕脂肪体作为生物反应器生产重组植酸酶等高附加值外源蛋白是可行的。