本文主要研究内容
作者卢欢（2019）在《发酵乳杆菌L-乳酸脱氢酶的筛选鉴定及其在L-丹参素合成中的应用》一文中研究指出：L-丹参素（L-DSS）是一种极具生理活性和药用价值的水溶性酚酸类化合物,以抗血栓、抗氧化、抗菌消炎、降血脂、改善微循环等显著药理作用,在预防和治疗心脑血管疾病方面有着广阔的开发前景。此外,它还是合成多种手性物质和生物活性物质的重要中间体。自然界中不存在L-丹参素,从植物丹参中分离得到的是它的对映异构体D-丹参素。对D-和L-丹参素的药理活性和强度进行比较,发现它们具有相同的药理活性,且L-丹参素的药学强度更加突出。近年来,陆续出现了化学合成L-丹参素的报道,但由于其存在污染严重、操作繁琐、成本高、产物光学纯度差、合成效率低等缺点,很大程度上受到了工业化应用的限制。因此,有必要探索出一条绿色安全、操作简单、效率高、成本低廉的合成单一手性L-丹参素的生物途径。研究表明,乳酸脱氢酶能立体选择性还原α-酮酸生成α-羟基羧酸,这为L-丹参素的生物合成提供了参考依据。本研究将L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因进行共表达,全细胞催化底物3,4-二羟基苯丙酮酸、葡萄糖生产L-丹参素。主要研究成果如下:（1）从实验室保藏的20株乳酸菌中筛选了一株具有较高3,4-二羟基苯丙酮酸还原活性的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum JN248）。通过对同菌属的Lactobacillus fermentum F-6的全基因组进行分析,从L.fermentum JN248中克隆到了5个L-乳酸脱氢酶基因（lf-l-ldh0845、lf-l-ldh1566、lf-l-ldh1732、lf-l-ldh0611和lf-l-ldh0372,蛋白分子量为3234 kDa）,连接到质粒pETDuet-1上,并导入大肠杆菌中进行诱导表达。对纯化前后的酶液进行SDS-PAGE分析和酶活力检测,发现这5个酶在理论蛋白分子量处都出现明显条带,且LF-L-LDH0845的酶活力最强。（2）对LF-L-LDH0845的酶学性质进行研究,结果发现:LF-L-LDH0845在pH6.0时活性最高且最稳定;最适温度为25℃,在10-25℃时稳定性较好;具有广泛的底物作用范围,最适底物为丙酮酸,其次为苯丙酮酸;对3,4-二羟基苯丙酮酸的Km、Kcat、Kcat/Km分别为11.3709 mM、0.2931 S-1、0.0258 mM-1·S-1。（3）利用来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶与LF-L-LDH0845一起构建了大肠杆菌BL21（DE3）/pETDuet-1-ldh-gdh双酶共表达菌株,以实现辅酶的再生。对诱导条件进行了优化,最佳诱导条件组合为:菌体浓度OD600=0.5,诱导剂浓度0.4 mmol·L-1,诱导温度20℃,诱导时长25 h。（4）对全细胞转化条件进行了优化,最佳转化条件为:转化温度25℃,转化体系pH=6.5,菌体湿重为20 g·L-1,3,4-二羟基苯丙酮酸浓度为70 mmol·L-1。最终,L-丹参素的产量达到15.91 g·L-1。
Abstract
L-dan can su （L-DSS）shi yi chong ji ju sheng li huo xing he yao yong jia zhi de shui rong xing fen suan lei hua ge wu ,yi kang xie shuan 、kang yang hua 、kang jun xiao yan 、jiang xie zhi 、gai shan wei xun huan deng xian zhe yao li zuo yong ,zai yu fang he zhi liao xin nao xie guan ji bing fang mian you zhao an kuo de kai fa qian jing 。ci wai ,ta hai shi ge cheng duo chong shou xing wu zhi he sheng wu huo xing wu zhi de chong yao zhong jian ti 。zi ran jie zhong bu cun zai L-dan can su ,cong zhi wu dan can zhong fen li de dao de shi ta de dui ying yi gou ti D-dan can su 。dui D-he L-dan can su de yao li huo xing he jiang du jin hang bi jiao ,fa xian ta men ju you xiang tong de yao li huo xing ,ju L-dan can su de yao xue jiang du geng jia tu chu 。jin nian lai ,liu xu chu xian le hua xue ge cheng L-dan can su de bao dao ,dan you yu ji cun zai wu ran yan chong 、cao zuo fan suo 、cheng ben gao 、chan wu guang xue chun du cha 、ge cheng xiao lv di deng que dian ,hen da cheng du shang shou dao le gong ye hua ying yong de xian zhi 。yin ci ,you bi yao tan suo chu yi tiao lu se an quan 、cao zuo jian chan 、xiao lv gao 、cheng ben di lian de ge cheng chan yi shou xing L-dan can su de sheng wu tu jing 。yan jiu biao ming ,ru suan tuo qing mei neng li ti shua ze xing hai yuan α-tong suan sheng cheng α-qiang ji suo suan ,zhe wei L-dan can su de sheng wu ge cheng di gong le can kao yi ju 。ben yan jiu jiang L-ru suan tuo qing mei he pu tao tang tuo qing mei ji yin jin hang gong biao da ,quan xi bao cui hua de wu 3,4-er qiang ji ben bing tong suan 、pu tao tang sheng chan L-dan can su 。zhu yao yan jiu cheng guo ru xia :（1）cong shi yan shi bao cang de 20zhu ru suan jun zhong shai shua le yi zhu ju you jiao gao 3,4-er qiang ji ben bing tong suan hai yuan huo xing de fa jiao ru gan jun （Lactobacillus fermentum JN248）。tong guo dui tong jun shu de Lactobacillus fermentum F-6de quan ji yin zu jin hang fen xi ,cong L.fermentum JN248zhong ke long dao le 5ge L-ru suan tuo qing mei ji yin （lf-l-ldh0845、lf-l-ldh1566、lf-l-ldh1732、lf-l-ldh0611he lf-l-ldh0372,dan bai fen zi liang wei 3234 kDa）,lian jie dao zhi li pETDuet-1shang ,bing dao ru da chang gan jun zhong jin hang you dao biao da 。dui chun hua qian hou de mei ye jin hang SDS-PAGEfen xi he mei huo li jian ce ,fa xian zhe 5ge mei zai li lun dan bai fen zi liang chu dou chu xian ming xian tiao dai ,ju LF-L-LDH0845de mei huo li zui jiang 。（2）dui LF-L-LDH0845de mei xue xing zhi jin hang yan jiu ,jie guo fa xian :LF-L-LDH0845zai pH6.0shi huo xing zui gao ju zui wen ding ;zui kuo wen du wei 25℃,zai 10-25℃shi wen ding xing jiao hao ;ju you an fan de de wu zuo yong fan wei ,zui kuo de wu wei bing tong suan ,ji ci wei ben bing tong suan ;dui 3,4-er qiang ji ben bing tong suan de Km、Kcat、Kcat/Kmfen bie wei 11.3709 mM、0.2931 S-1、0.0258 mM-1·S-1。（3）li yong lai yuan yu ku cao ya bao gan jun de pu tao tang tuo qing mei yu LF-L-LDH0845yi qi gou jian le da chang gan jun BL21（DE3）/pETDuet-1-ldh-gdhshuang mei gong biao da jun zhu ,yi shi xian fu mei de zai sheng 。dui you dao tiao jian jin hang le you hua ,zui jia you dao tiao jian zu ge wei :jun ti nong du OD600=0.5,you dao ji nong du 0.4 mmol·L-1,you dao wen du 20℃,you dao shi chang 25 h。（4）dui quan xi bao zhuai hua tiao jian jin hang le you hua ,zui jia zhuai hua tiao jian wei :zhuai hua wen du 25℃,zhuai hua ti ji pH=6.5,jun ti shi chong wei 20 g·L-1,3,4-er qiang ji ben bing tong suan nong du wei 70 mmol·L-1。zui zhong ,L-dan can su de chan liang da dao 15.91 g·L-1。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的卢欢，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于丹参素论文,乳酸脱氢酶论文,酶学性质论文,葡萄糖脱氢酶论文,全细胞催化论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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