人DR5胞外段基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

论文摘要

背景死亡受体5（death receptor , DR5）是肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL）的主要受体之一,DR5与TRAIL结合后可以通过其胞内的死亡结构域传递凋亡信号,从而引起细胞凋亡的发生,是激活凋亡途径的很好的靶标。TRAIL可引起许多肿瘤细胞系的凋亡,对绝大多数正常细胞不具有凋亡效应,被认为是癌症治疗的潜在的生物制剂。随着研究的深入,出现了关于TRAIL可以引起正常肝脏细胞的凋亡的报道。于是人们转入了对抗DR5单克隆抗体的研究上来。由于TRAIL的功能发挥主要靠DR5介导凋亡信号,如能得到没有肝脏细胞毒性又能活化DR5的单克隆抗体,将可以做为TRAIL的替代物进行药物研制。目的获得具有生物活性的人DR5胞外段蛋白,制备具有活性的抗DR5单克隆抗体。方法通过RT-PCR从Jurkat细胞中钓取DR5的胞外段基因（55-183位氨基酸）,克隆到pGEM?-T Easy载体中,经核酸序列测定正确后,将其再次克隆入原核表达载体pET-30a中,在E.coli BL21 （DE3）实现蛋白表达。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。ELISA法分析其与抗DR5单克隆抗体（mAb）结合能力,用DR5胞外段竞争阻断TRAIL对Jurkat细胞生长的抑制。通过杂交瘤技术筛选抗DR5单克隆抗体（A6）。MTT法检测了A6对Jurkat细胞的生长抑制作用。吉姆萨染色、PI/Annexinv双染检测了A6对Jurkat的凋亡作用。通过竞争ELISA方法分析了A6和TRAIL的作用位点的异同。结果克隆到人DR5基因的胞外段基因,测序结果和报道的一致;构建了人DR5胞外段基因的原核表达载体并实现在E.coli BL21 （DE3）中大量表达;SDS-PAGE表明所表达蛋白与预期蛋白分子量一致;Western blot及ELISA的结果表明该蛋白能与抗DR5抗体反应,竞争阻断试验表明DR5胞外段可阻断TRAIL对Jurkat细胞生长的抑制。成功制备了一株活性较好的抗DR5单克隆抗体-A6。MTT法显示了A6对Jurkat细胞的生长抑制作用,在25μg/mL的浓度下,作用16小时,可以达到对Jurkat细胞90﹪的生长抑制率。吉姆萨染色从形态上显示了Jurkat细胞的凋亡。PI/AnnexinⅤ双染分析显示:Jurkat细胞经过250 ng/mL浓度的A6作用12小时后,Jurkat细胞的凋亡率可以达到52.46﹪。用40倍浓度的TRAIL和A6做竞争ELISA,结果显示了TRAIL和A6的作用位点是不同的。结论（1）成功地制备了具有生物活性的DR5胞外区。（2）制备了一株抗DR5单克隆抗体A6。

论文目录

中文摘要

英文摘要

引言

第一部分 DR5 胞外段基因的表达及功能初步鉴定

1 前言

2 材料

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器

3 方法

3.1 细胞培养

3.2 总 RNA 的提取

3.3 甲醛变性电泳检测

3.4 RT-PCR

3.5 pGEM-DR5 构建及鉴定

3.6 DR5 胞外段基因序列测定

3.7 DR5 的原核表达质粒构建及鉴定

3.8 重组 DR5 的表达及制备

3.9 重组 DR5 的鉴定

4 结果

4.1 Jurkat 细胞总 RNA 的提取

4.2 DR5 胞外段基因的 RT-PCR

4.3 pGEM-DR5 构建及鉴定

4.4 中介重组体的测序结果

4.5 pET-DR5 的构建及鉴定

4.6 DR5 胞外段蛋白的诱导表达、纯化及Western Blot 分析

4.7 重组DR5 的免疫印迹

4.8 DR5 胞外段蛋白和抗 DR5 抗体的结合活性

4.9 重组 DR5 抑制 TRAIL 诱导 Jurkat 细胞凋亡的活性

5. 讨论

6. 参考文献

第二部分抗人DR5 单克隆抗体的筛选和功能初步鉴定

1 序言

2 材料和方法

2.1 细胞系

2.2 DR5 胞外段蛋白的制备

2.3 sDR5 免疫小鼠

2.4 细胞融合和杂交瘤的筛选

2.5 ELISA 法筛选单克隆抗体

2.6 抗体亚类的鉴定

2.7 Lowry 法蛋白定量

2.8 MTT法测定抗体对Jurkat细胞的生长抑制功能

2.9 吉姆萨-瑞氏染色

2.10 PI/AnnexinⅤ染色流式细胞仪分析Jurkat 细胞凋亡

2.11 单克隆抗体和 TRAIL 的竞争 ELISA

3 实验结果

3.1 抗DR5 单克隆抗体的产生

3.2 抗 DR5 单克隆抗体 A6 的纯化

3.3 A6 的Lowry 法蛋白定量

3.4 A6 对Jurkat 细胞的生长抑制作用曲线

3.5 吉姆萨-瑞氏染色结果

3.6 PI/AnnexinⅤ染色流式细胞仪分析Jurkat 细胞凋亡

3.7 A6 和TRAIL 的竞争ELISA 作用

4 讨论

5 参考文献

第三部分总结

第四部分文献综述

主要缩略语

致谢

附录

人DR5胞外段基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢