论文摘要
结直肠癌（Colorectal Carcinoma,CRC）是人类常见的恶性肿瘤,其发病率、死亡率有逐年上升的趋势。在西方国家,结直肠癌居各种癌肿死因的第二位,美国每年约有～14,000例的新增结直肠癌病例,且每年约有～5,000人死于结直肠癌。流行病学调查结果显示,男女均好发结直肠癌,但各年龄段男性的结直肠癌的发生率均高于女性,而且绝经后的妇女患结肠癌的风险比绝经前妇女高,雌激素替代疗法可以降低绝经后妇女患结肠癌的风险约30～40%,因此雌激素可能对结直肠癌的发生起一定的保护作用。雌激素是通过雌激素受体（Estrogen Receptor,ER）发挥其生物学活性的。ERα（ERα66）是最先发现的雌激素受体,属于核受体超家族成员。其可分为六个功能区（A-F）。N端A/B区含有一个配基非依赖性的转录激活功能区AF-1,负责配体非依赖的转录激活功能。C区负责受体二聚体的形成及结合特殊的DNA序列。C端E/F区含有一个配基依赖性的转录激活功能区AF-2,其对雌激素受体的配体依赖性转录激活功能起调节作用。其后,人们发现了其他一些雌激素受体,包括ERβ,以及ERα、ERβ的亚型。ERα46是近年来人们从人乳腺癌MCF-7细胞、骨肉瘤细胞、及血管表皮细胞中发现的ERα的亚型。与野生型ERα（ERα66）相比,该受体缺失非配基依赖性转录激活功能区AF-1,编码46kDa大小的蛋白,故命名为ERα46。有研究表明ERα46在非生殖器官组织中的转录水平高于生殖器官组织,但尚未有文献报道其与人类结直肠肿瘤之间的关系。我们的前期工作表明,ERα66并不是唯一表达在结直肠癌组织中的雌激素受体,ERα46的表达水平也很高。因此我们推测ERα46或许对结直肠癌的发生发展起一定的作用。为了研究ERα46与人类结直肠癌的关系,本课题检测了ERα46在32对结直肠癌及其相对应的正常结直肠组织中的表达水平;构建了ERα46的真核表达载体,并在人结肠癌细胞系HT-29中得到稳定表达;研究了ERα46介导雌激素对结肠癌细胞HT-29的生长、侵袭及凋亡的影响。具体内容如下:1.ERα46在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达水平用逆转录-实时荧光定量PCR技术,检测ERα46在结直肠癌及其相对应的癌旁正常组织中的表达,分析该指标的改变及其与各临床病理指标（临床分期、年龄、分化程度）的关系。结果表明:在大肠癌组织中,ERα46的表达显著低于相应的癌旁正常组织（P=0.008）。但ERα46的表达与大肠癌浸润深度及分化程度无相关性（P＞0.05）。2.ERα46真核表达载体的构建及其表达为了获得ERα46 cDNA,本课题以pcDNA3.1-ERα66为模板,经PCR,扩增得到1400bp cDNA片段,克隆于pGEM-T Easy载体,经DNA测序并与GenBank数据库序列进行比对,证实该cDNA片段即为预期的含ERα46全长编码区的cDNA。用EcoR1酶切将该片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）,并经酶切鉴定。将上述表达ERα46的载体稳定转染结肠癌细胞HT-29,经Western blot鉴定该蛋白表达在HT-29细胞中。3.ERα46的表达对HT-29细胞增殖、侵袭及凋亡功能的影响应用MTT法检测ERα46介导的雌激素对HT-29细胞体外生长能力的影响,结果表明,在雌激素的作用下,转染ERα46的HT-29细胞的增殖能力明显低于转染空载体的对照细胞。流式细胞仪检测表明转染ERα46的HT-29细胞,G0╱1期细胞比例增多,而G2/M期细胞比例减少。体外侵袭实验显示,在雌激素的作用下,转染ERα46的HT-29细胞的侵袭能力低于对照组（P＜0.05）。进一步DNA Fragmentation检测表明,在雌激素的作用下,转染ERα46的HT-29细胞显示了凋亡条带,而转染空载体的细胞未见凋亡条带。TUNEL实验也表明:在雌激素的作用下,转染ERα46的HT-29细胞比转染空载体的细胞显示了更多的凋亡细胞（P＜0.05）。结论:1.ERα46在结直肠癌中的表达低于癌旁正常组织。2.建立了稳定表达ERα46的HT-29结肠癌细胞系。3.在雌激素的作用下,ERα46介导HT-29细胞的生长、侵袭抑制及细胞凋亡。