聚乙二醇修饰对蛋白质的脱酰胺与二硫键的影响研究

论文摘要

蛋白质药物因其具有高活性、特异性强和生物功能明确等特点使其应用日益广泛,但蛋白质的不稳定性使其在储存或运输过程中常出现脱酰胺降解、二硫键错配以及聚集形成沉淀等现象,造成蛋白质的活性损失甚至产生一定的副作用,降低了其临床使用效果。本论文以重组人血管内皮抑制素和重组人粒细胞集落刺激因子为模型蛋白,利用液相色谱质谱联用技术结合蛋白质酶解技术研究了蛋白质储存过程中发生的脱酰胺过程及二硫键变化,继而对二者进行PEG修饰,重点考察PEG修饰对蛋白质储存过程中脱酰胺与二硫键的影响。本论文从三个方面对药用蛋白质的储存稳定性开展了研究探索。首先,系统研究了重组人血管内皮抑制素在不同储存条件下天冬酰胺的脱酰胺变化,结果表明该蛋白序列中与Gly相连的Asn127在储存过程发生了脱酰胺反应,实验研究不同条件下Asn127脱酰胺过程的动力学并系统考察了不同pH和温度下脱酰胺过程动力学参数,结果表明在实验选择的条件下脱酰胺过程随pH与温度的升高,反应速率加快。其次,研究了重组人粒细胞集落刺激因子中的二硫键连接方式及其对蛋白质稳定性的影响,蛋白酶解产物中检测出分子间二硫键Cys18-Cys18及错配的二硫键Cys18-Cys37、Cys18-Cys65或Cys37-Cys75。蛋白浓度从0.5 mg/mL增加到1.0 mg/mL、1.52 mg/mL,分子间二硫键Cys18-Cys18的含量在其浓度基础上依次增加15.25%、105.08%,表明分子间二硫键在一定范围内受浓度影响,浓度增加可加剧其形成过程。检测出含分子间二硫键的多肽（MW 15710 Da）,该多肽含量随浓度的增加减少且该过程伴随沉淀产生,证明了蛋白质沉淀过程与分子间二硫键形成密切相关。第三部分主要研究了PEG修饰对蛋白质脱酰胺过程和二硫键的影响。采用mPEG-ALD （20 kDa）对原蛋白进行修饰,利用蛋白质酶解技术结合多级质谱技术研究了修饰前后多肽含量的变化并确定修饰位点；研究了PEG修饰对脱酰胺及二硫键的影响,考察了脱酰胺速率常数,结果表明修饰后pH和温度对脱酰胺速率影响降低,但当温度达到一定条件时,加剧了脱酰胺反应的进行。考察修饰后的二硫键,未发现除Cys18-Cys18外错配的二硫键且该二硫键的含量与其浓度呈正比,较未修饰前识别到多肽Leu36-Arg147且修饰后无明显沉淀产生；结果表明PEG修饰可阻止蛋白质分子间二硫键形成并在一定程度上降低脱酰胺反应速率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 蛋白质药物概况
• 1.1.1 蛋白质药物的种类
• 1.1.2 蛋白质药物的研发趋势及分布
• 1.1.3 蛋白质药物存在的问题及解决办法
• 1.1.4 聚乙二醇修饰蛋白技术
• 1.1.4.1 聚乙二醇的理化特性
• 1.1.4.2 聚乙二醇修饰方法
• 1.1.4.3 聚乙二醇修饰蛋白药物国内外研发现状
• 1.2 蛋白质结构及其研究方法
• 1.2.1 蛋白质基本结构
• 1.2.2 蛋白质结构研究常用方法
• 1.2.2.1 X-ray衍射
• 1.2.2.2 核磁共振
• 1.2.2.3 圆二色光谱
• 1.3 蛋白质储存稳定性研究进展
• 1.3.1 物理不稳定性
• 1.3.2 化学不稳定性
• 1.3.2.1 脱酰胺反应
• 1.3.2.2 氧化作用
• 1.3.2.3 还原作用
• 1.3.2.4 水解作用
• 1.3.2.5 其他化学降解
• 1.4 蛋白质储存稳定性研究方法
• 1.4.1 电泳法
• 1.4.2 高效毛细管电泳法
• 1.4.3 高效液相色谱法
• 1.4.3.1 反相色谱
• 1.4.3.2 凝胶过滤色谱
• 1.5 生物质谱技术及其在蛋白质研究中的应用
• 1.5.1 生物质谱技术
• 1.5.1.1 电喷雾质谱技术
• 1.5.1.2 基质辅助激光解吸附质谱技术
• 1.5.2 生物质谱在蛋白质研究中的应用
• 1.5.2.1 蛋白质和多肽的分子量测定
• 1.5.2.2 蛋白质和多肽的序列分析
• 1.5.2.3 蛋白质识别
• 1.5.2.4 质谱在蛋白质脱酰胺研究中的应用
• 1.5.2.5 质谱在蛋白质二硫键研究中的应用
• 1.5.2.6 质谱在蛋白质其它翻译后修饰分析中的应用
• 1.5.2.7 质谱在生物大分子相互作用研究中的应用
• 1.6 本论文的研究内容
• 第二章 重组人血管内皮抑制素脱酰胺研究
• 2.1 引言
• 2.1.1 脱酰胺
• 2.1.2 重组人血管内皮抑制素
• 2.2 质谱分析重组人血管内皮抑制素的脱酰胺
• 2.2.1 材料与仪器
• 2.2.1.1 材料与试剂
• 2.2.1.2 仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 rhEndostatin样品处理
• 2.2.2.2 高效液相色谱质谱（HPLC-MS）分析
• 2.2.2.3 飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析
• 2.2.2.4 数据处理
• 2.2.3 结果与讨论
• 2.2.3.1 质谱法识别脱酰胺位点
• 2.2.3.2 pH对脱酰胺过程的影响
• 2.2.3.3 温度对脱酰胺过程的影响
• 2.3 本章小结
• 第三章 重组人粒细胞集落刺激因子二硫键研究
• 3.1 引言
• 3.1.1 二硫键
• 3.1.2 重组人粒细胞集落刺激因子
• 3.2 质谱分析重组人粒细胞集落刺激因子的二硫键
• 3.2.1 材料与仪器
• 3.2.1.1 材料与试剂
• 3.2.1.2 仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 rhG-CSF样品处理
• 3.2.2.2 高效液相色谱质谱（HPLC-MS）分析
• 3.2.2.3 基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析
• 3.2.2.4 数据处理
• 3.2.3 结果与讨论
• 3.2.3.1 质谱法结合胰蛋白酶酶解识别分子间二硫键
• 3.2.3.2 质谱法结合胰凝乳蛋白酶酶解识别分子内二硫键
• 3.2.3.3 溶液浓度对分子间二硫键的影响
• 3.3 本章小结
• 第四章 PEG修饰蛋白脱酰胺及二硫键研究
• 4.1 引言
• 4.2 PEG定点修饰rhEndostatin与rhG-CSF
• 4.2.1 材料与仪器
• 4.2.1.1 材料与试剂
• 4.2.1.2 仪器
• 4.2.2 PEG修饰重组人血管内皮抑制素
• 4.2.2.1 PEG修饰过程
• 4.2.2.2 PEG修饰产物的分离纯化
• 4.2.2.3 MALDI-TOF MS分析PEG修饰产物
• 4.2.3 PEG修饰重组人粒细胞集落刺激因子
• 4.2.3.1 PEG修饰过程
• 4.2.3.2 PEG修饰产物的分离纯化
• 4.2.3.3 MALDI-TOF MS分析PEG修饰产物
• 4.3 质谱法鉴别PEG修饰位点
• 4.3.1 材料与仪器
• 4.3.1.1 材料与试剂
• 4.3.1.2 仪器
• 4.3.2 实验方法
• 4.3.2.1 样品处理
• 4.3.2.2 高效液相色谱质谱（HPLC-MS）分析条件
• 4.3.3 结果与讨论
• 4.3.3.1 rhEndostatin的PEG修饰位点
• 4.3.3.2 rhG-CSF的PEG修饰位点
• 4.4 质谱法分析PEG修饰rhEndostatin的脱酰胺
• 4.4.1 材料与仪器
• 4.4.2 试验方法
• 4.4.3 结果与讨论
• 4.4.3.1 质谱法识别PEG修饰后脱酰胺位点
• 4.4.3.2 pH对脱酰胺过程的影响
• 4.4.3.3 温度对脱酰胺过程的影响
• 4.5 质谱法分析PEG修饰rhG-CSF的二硫键
• 4.5.1 材料与仪器
• 4.5.2 试验方法
• 4.5.3 结果与讨论
• 4.5.3.1 质谱法识别分子内及分子间二硫键
• 4.5.3.2 溶液浓度对分子间二硫键的影响
• 4.6 本章小结
• 第五章 结论
• 5.1 主要研究结论
• 5.2 后续研究设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者及导师简介