有机磷杀虫剂毒死蜱经氧化胁迫诱导小鼠视网膜细胞凋亡及维生素C和E的联合保护作用

论文摘要

有机磷杀虫剂毒死蜱（CPF）在全球农业生产和公共卫生项目中的广泛使用,已经引起了严重的环境污染和健康危害,包括急、慢性人类中毒。视网膜也是CPF作用的靶器官之一。但目前对其中毒机制还不十分明了。以前的研究主要侧重于CPF对视网膜细胞中乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。本研究主要是探讨CPF能否诱导小鼠视网膜细胞产生氧化胁迫并致其凋亡,而联合应用维生素C和E对CPF的视毒性是否有抑制作用。试验小鼠被随机分成4组（每组20只）:对照组（Control）;维生素C加维生素E处理组（VC+VE）;毒死蜱处理组（CPF）;和CPF加维生素C和维生素E处理组（CPF+VC+VE）。VC+VE组和CPF+VC+VE组用维生素C 250 mg/kg和维生素E 150mg/kg预处理,皮下注射,每天1次,持续6天。其它组同时皮下注射生理盐水。之后,CPF组和CPF+VC+VE组通过强迫饲喂给予CPF（63 mg/kg）,该剂量为半致死剂量的1/4。在CPF处理24小时后,所有的鼠麻醉后被杀死,摘除视网膜。部分视网膜被用来做电镜标本,观察其细胞的形态学改变,以及用共聚焦显微镜检测钙离子浓度。部分视网膜被分离成单细胞悬液进行彗星电泳,AO/EB双重染色,以及用流式细胞仪检测细胞凋亡。剩余的视网膜被制成匀浆用来检测丙二醛（MDA）含量,超氧化物歧化酶（SOD）活性,过氧化氢酶（CAT）活性,谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性和乙酰胆碱酯酶（AChE）活性。结果显示:CPF组小鼠视网膜细胞中产生了脂质过氧化,DNA损害程度增强,部分细胞发生凋亡,同时抗氧化酶SOD、CAT和GPX的活性降低,而抗氧化剂维生素C和E的联合使用则可以明显抑制CPF的这些细胞毒作用,这说明CPF所诱导的小鼠视网膜细胞凋亡确实是由氧化胁迫造成的。我们还观察到,CPF还可以抑制小鼠视网膜细胞中的AChE活性,并促进其胞内钙离子浓度增加,而联合应用维生素C和E,对这些作用具有明显和有效的抑制效果。我们的结果说明:①有机磷杀虫剂CPF可经由氧化胁迫途径诱导小鼠视网膜细胞凋亡,在该过程中CPF降低了AChE活性并增加了细胞内钙离子的浓度。本研究结果有助于进一步阐明CPF和其它有机磷杀虫剂引起中毒的机制;②外源性抗氧化剂维生素C和E的联合应用,明显地降低了CPF对小鼠视网膜细胞的损害作用。上述研究结果提示,在临床治疗有机磷杀虫剂引起的视毒性时,除了使用传统的解毒剂进行治疗外,如果再结合使用维生素C和E的抗氧化治疗,也许会收到更好的效果。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 前言
• 1.1 有机磷杀虫剂
• 1.1.1 产量、用途、接触及使用情况
• 1.1.2 中毒概况
• 1.1.3 OPI对人与动物的影响
• 1.2 OPI中毒视网膜损伤机制
• 1.2.1 AChE机制
• 1.2.2 氧化胁迫机制
• 1.3 维生素C和维生素E的保护作用
• 1.3.1 维生素C的生物功能
• 1.3.2 维生素C的抗氧化作用
• 1.3.3 维生素E的分子结构、生理活性和主要功能
• 1.3.4 维生素E的抗氧化作用
• 1.3.5 维生素C或维生素E缺乏与眼疾病
• 1.3.6 维生素C和维生素E的联合抗氧化作用
• 1.3.7 有关维生素C和维生素E的使用剂量
• 1.4 OPI与细胞凋亡
• 1.4.1 细胞凋亡的概念
• 1.4.2 细胞凋亡的生物学特征
• 1.4.3 OPI诱导细胞凋亡机制
• 1.4.4 OPI诱导细胞凋亡的判断依据
• 1.5 毒死蜱的毒理学研究进展
• 1.5.1 毒死蜱的概念
• 1.5.2 CPF的分子式及结构式
• 1.5.3 CPF的理化性质及用途
• 1.5.4 CPF的生物代谢
• 1.5.5 CPF对脑细胞发育的影响
• 1.5.6 CPF的致畸性
• 1.5.7 CPF对人类志愿者的实验结果
• 1.5.8 CPF在动物实验中低剂量重复接触与大剂量一次性接触的年龄差别
• 1.6 OPI与眼毒性
• 1.6.1 相关实验室研究
• 1.6.2 临床病例发现
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试验仪器
• 2.2 药品和试剂
• 2.3 动物及处理
• 2.4 视网膜单细胞分离
• 2.5 细胞凋亡分析
• 2.5.1 形态学观察
• 2.5.2 细胞凋亡的定量分析——异硫氰酸荧光素标记Annexin V（Annexin V-FITC）检测凋亡
• 2.6 MDA分析
• 2.7 单细胞电泳（SCGE）
• 2.8 各种抗氧化酶测定
• 2.8.1 SOD活性测定
• 2.8.2 CAT活性测定
• 2.8.3 GPX活性测定
• 2.9 AChE的测定
• 3.10 蛋白含量测定
• 3.11 激光共聚焦显微镜（LSCM）检测细胞内游离钙离子浓度
• 3.12 统计分析
• 3 结果
• 3.1 CPF可诱导小鼠的视网膜细胞凋亡
• 3.2 CPF可诱导小鼠视网膜细胞中的活质分子的损伤
• 3.3 维生素C和E的联合保护作用
• 3.4 维生素C和E的联合应用提高了AChE的活性
• 3.5 维生素C和E的联合应用降低了小鼠视网膜细胞内游离钙的浓度
• 4 讨论
• 4.1 CPF确实有使眼睛致毒的作用
• 4.2 高比例的多不饱和脂肪酸是视网膜易于氧化胁迫的组织学基础
• 4.3 氧化胁迫加剧了CPF视网膜致毒
• 2+]_i上调参与了CPF视网膜致毒'>4.4 AChE抑制和[Ca²⁺]_i上调参与了CPF视网膜致毒
• 4.5 视网膜细胞内钙离子增加加剧了视网膜细胞的凋亡
• 4.6 抗氧化剂维生素C和E对视网膜的保护作用
• 4.7 结论
• 参考文献
• 在学期间研究成果
• 致谢