骨桥蛋白在大鼠脑创伤中的作用研究

论文摘要

第一部分骨桥蛋白（OPN）添加对大鼠脑创伤影响的实验研究目的:研究OPN添加对大鼠脑创伤的作用。方法:1.建立培养大鼠脑皮质神经细胞离心损伤模型。模型建立后立即分别添加生理盐水或不同浓度（0.01μg/ml、0.05μg/ml和0.1μg/ml）OPN。分别于伤后24h、48h、72h、120h和168h收集培养神经细胞,用MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.制作大鼠侧方液压冲击（LFP）脑创伤模型,研制大鼠呼吸面罩。大鼠中度LFP脑创伤后24h内分别行立体定向脑室内注射生理盐水5μl或OPN5μl（50ng）。于伤后72h、120h和168h分别进行大鼠神经学评分、行走和平衡运动功能检测,Morris水迷宫记忆功能评价。随后大鼠行心脏灌注取脑,原位细胞凋亡检测。结果:1.添加OPN后神经细胞增殖活跃,凋亡率降低,呈剂量依赖关系。2.应用面罩呼吸机辅助呼吸,LFP脑创伤大鼠的死亡率由30%降低到11.84%。3.脑室内注射OPN后LFP脑创伤大鼠水迷宫记忆力、神经学评分、行走和平衡功能改善。结论:OPN可促进培养的神经胶质细胞增殖,抑制神经细胞凋亡。脑室内注射OPN可促进脑创伤后大鼠的记忆力和神经功能恢复,呈剂量依赖关系。第二部分OPN表达封闭对大鼠脑创伤影响的实验研究目的:研究OPN基因沉默对大鼠脑创伤的影响。方法:1.用载体TG005构建OPN表达载体:根据OPN基因信息设计并合成引物。提取胎鼠心肌总RNA,反转录合成cDNA,PCR合成目的片段。目的片段经Mlu1和Spe1双酶切、纯化。载体双酶切,去磷酸化。酶切目的片段和酶切载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,提取重组质粒,双酶切后测序鉴定命名为TG005-OPN。TG005-OPN与脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞,RT-PCR检测,电泳鉴定。2.构建OPN特异性RNAi慢病毒载体:根据OPN基因信息设计3条shRNA序列:OPN-Sh1:ACGATGATGACGACGACGA,OPN-Sh2:ATGACGACGACGATGACGA,OPN-Sh3:AGCACACAAGCAGACGTTT。合成三对互补的DNA片段,PCR扩增后用BamH I和Xho I双酶切,纯化,载体pRNAi-U6.2/Lenti双酶切,去磷酸化。酶切DNA片段与酶切载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,测序鉴定并命名为Lv-OPN-Sh。3.慢病毒载体包装,鉴定:用Lipofectamine 2000将慢病毒载体4质粒（pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G及Lv-OPN-Sh）转移至293T包装细胞,产生重组慢病毒颗粒。重组慢病毒颗粒与TG005-OPN共转染293T细胞,组织蛋白抽提及Western检测OPN基因沉默效果。4.慢病毒重组颗粒转染大鼠创伤神经细胞,检测神经细胞凋亡。5.慢病毒重组颗粒5μl/空载体5μl/生理盐水5μl/TG005-OPN 5μl分别行LFP脑创伤大鼠脑室内注射。于伤后72h、120h和168h分别进行大鼠神经行为学评价及记忆功能评价。结果:1.TG005与目的插入片段连接阳性菌落酶切电泳显示插入片段约1000bp,该片段测序并与GenBank中OPN序列比较证明该片段为OPN,OPN表达载体TG005-OPN制备成功。2.pRNAi-U6.2/Lenti载体与设计合成的3条OPN-shRNA连接,阳性菌落测序鉴定证明3个质粒构建成功并分别命名为Lv-OPN-Sh（1,2,3）。3.脂质体及慢病毒四质粒共转染包装细胞293T,荧光显微镜下见大量绿色荧光,证实有大量质粒转染入293T细胞。4.TG005-OPN与慢病毒共转染293T后Western检测显示Lv-OPN-Sh2可明显抑制OPN表达。5.Lv-OPN-Sh2慢病毒重组颗粒转染损伤神经细胞,神经细胞凋亡率增加,但无统计学意义。6.Lv-OPN-Sh2慢病毒重组颗粒脑室内注射后,大鼠的神经行为功能和记忆功能无明显改变。结论:慢病毒载体介导的OPN特异性RNAi基因沉默对大鼠创伤神经细胞的凋亡影响不明显,对LFP脑创伤大鼠的运动功能和记忆功能影响也不明显。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 第一部分 OPN添加对大鼠脑创伤影响的实验研究
• 一、OPN对体外培养大鼠脑皮质细胞离心损伤影响的实验研究
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、OPN脑室内注射对LFP脑创伤大鼠影响的实验研究
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第二部分 OPN基因沉默对大鼠脑创伤影响的实验研究
• 一、OPN基因沉默对体外培养大鼠脑皮质细胞离心损伤影响的实验研究
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、OPN基因沉默对LFP脑创伤大鼠影响的实验研究
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 骨桥蛋白研究进展
• 综述参考文献
• 致谢