离子束照射诱变技术构建生物乙醇高产酵母菌株

论文摘要

燃料乙醇的开发和利用以后将会是一个重要的生物能来源。本课题就是从利用酵母菌发酵生产酒精的角度，培育出一株能够有效利用五碳糖和六碳糖的酵母菌来发酵生产生物乙醇。本实验从酒精酵母（Saccharomyces cerevisiae）的二倍体入手，培育筛选出随机孢子，分析鉴定得到单倍体并对其进行发酵性能进行测定，筛选出一株发酵性能相对较好的单倍体A-06。对亲本菌株酿酒酵母的原生质体A-06和嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）B-12的原生质体的形成条件进行测定，其培养其最佳条件为：摇床震荡培养12h的菌体，2%的蜗牛酶和2%的纤维素酶的混合酶液30℃水浴酶解1h，原生质体的形成率分别为94.7%和92.5%。之后对亲本的细胞融合的最佳的培养条件进行对比测定，测定其最佳的培养条件为27℃，pH6.06.5，摇床震荡培养120rpm。采用两种不同的灭活方法对亲本菌株的原生质体进行融合。利用不同剂量和时间的紫外线灭活的方法对亲本酒精酵母A-06的原生质体进行彻底灭活，最佳的灭活条件为30W紫外灯下距离30cm垂直照射1min。采用高温水浴的方法对亲本管囊酵母B-12的原生质体进行彻底灭活，最佳灭活条件为65℃水浴1h。利用PEG作为促融剂诱导灭活双亲的原生质体进行融合，经过TTC平板颜色反应的初筛、复筛及特征性蛋白电泳的鉴定，获得一株能够进行木糖发酵的性能优良的融合子菌株C-05。经过测定，其酒精发酵度达到1.26ml/100ml，比亲本B-12提高了8.04%。而后采用紫外线照射C-05对其进行诱变，经过多重筛选并测定，发现酒精产率变化不大，并没有成功诱变出理想菌株。通过不同剂量的氮离子束照射融合子，并统计照射后的致死率，根据照射后的处理致死率，其中剂量为8×1015，照射时间为512s的致死率最高，达到98.4%。培育并筛选其子代菌株，并测定其子代菌株的遗传稳定性。最后利用含有不同浓度木糖和葡萄糖比例的培养液进行菌体发酵性能的测定，最终筛选出一株能够稳定遗传的子代菌株D-08。诱变后的子代菌株其酒精产率和亲本相比提高了10%，同时木糖利用率也有所提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 能源的枯竭与生物能的开发
• 1.2 我国能源现状
• 1.3 燃料乙醇的概念和发展概况
• 1.4 生产生物乙醇的原料—纤维素
• 1.5 原生质体融合
• 1.5.1 原生质体融合的定义
• 1.5.2 细胞融合的起源和发展
• 1.6 与木糖发酵相关的菌株
• 1.7 本课题的目的和意义
• 1.8 本实验的创新之处
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 酶制剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 酒精酵母单倍体的制备
• 2.2.2 酒精酵母单倍体鉴定及筛选
• 2.2.3 子代酒精酵母单倍体制备和再生
• 2.2.4 管囊酵母原生质体制备和再生
• 2.2.5 双亲原生质体灭活条件的研究
• 2.2.6 双亲原生质体的融合及其最佳培养条件的测定
• 2.2.7 融合子的筛选及鉴定
• 2.2.8 融合子遗传稳定性的试验
• 2.2.9 紫外照射诱变
• 2.2.10 离子束照射诱变
• 2.2.11 不同浓度混合糖发酵诱变后菌株
• 2.3 测定方法
• 2.3.1 总糖含量测定 DNS 法
• 2.3.2 木糖含量测定地衣酚法
• 2.3.3 酒精度测定重铬酸钾法
• 第三章 实验结果
• 3.1 酒精酵母单倍体的制备及其发酵性能的测定
• 3.1.1 单倍体的制备
• 3.1.2 单倍体产乙醇性能的测定
• 3.2 不同酶液组合和酶解时间对酒精酵母原生质体和再生的影响
• 3.2.1 不同酶液对原生质体的影响
• 3.2.2 不同酶解时间对原生质体的影响
• 3.3 双亲原生质体灭活条件的研究
• 3.3.1 管囊酵母原生质体紫外灭活条件的测定
• 3.3.2 酿酒酵母原生质体高温灭活条件的测定
• 3.4 融合子最佳培养条件的测定
• 3.5 融合子筛选及其鉴定结果
• 3.6 采用全糖发酵对融合子复筛
• 3.7 融合子的特征性蛋白电泳图谱
• 3.8 紫外照射诱变的研究
• 3.9 离子束照射诱变的研究
• 3.10 诱变后菌株不同比例混合糖发酵特性测定
• 第四章 分析与讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢