大鼠肝细胞IL-10及其受体的表达与作用

论文摘要

目的通过建立大鼠肝纤维化及IL-10干预模型,研究肝纤维化大鼠肝组织中IL-10的表达和变化,探讨外源性IL-10对肝细胞的作用;通过外源性IL-10对原代肝细胞进行培养干预,了解IL-10对肝细胞增殖、凋亡的影响,并分析其相关生长因子的表达变化。方法动物实验部分:建立大鼠肝纤维化和IL-10干预模型,抽提肝脏总RNA,Real-Time PCR法检测模型组与正常组IL-10表达的差异,原位Tunnel法检测IL-10对肝细胞凋亡的影响;免疫组织化学法、RT-PCR检测肝组织Bax/Bcl-2蛋白及mRNA的表达。细胞实验部分:通过胶原蛋白酶原位灌流法分离大鼠原代肝细胞, RT-PCR法检测肝内不同细胞标志基因,如:ALB、CK19、AFP、CYP8B1、CD68、CD31等基因的表达情况,并进行细胞纯度鉴定、冻存研究、复苏培养、细胞活性鉴定等;RT-PCR、Western-blot检测原代肝细胞IL-10/IL-10R1 mRNA和蛋白的表达情况;原代肝细胞分三组培养:正常组（N组,普通培养基）、对照组（C组,含胰岛素培养基）和IL-10干预组（I组,含IL-10、胰岛素的培养基）,通过MTT分析、台盼兰细胞计数以及流式细胞仪细胞周期、流式AnnexinV、AO-EB法等检测手段,了解外源性IL-10对原代肝细胞增殖与凋亡的影响;同时,半定量RT-PCR法分析IL-10对大鼠原代肝细胞生长因子mRNA表达的影响。结果成功构建大鼠肝纤维化及IL-10治疗模型,Real-Time PCR结果提示,纤维化组肝组织IL-10mRNA的表达较正常组下降（14.67%,P<0.01）;原位TUNEL法检测显示,IL-10治疗组肝细胞凋亡数量较对照组明显降低（19.23%,P<0.01）。免疫组化检测提示IL-10治疗组Bax表达较对照组显著降低（62.08%,P<0.01）;RT-PCR结果显示治疗组较对照组Bax/Bcl-2 mRNA表达均下调（Bax:76.54%,P<0.05; Bcl-2: 32.03%,P<0.01）。成功分离大鼠原代肝细胞,细胞鉴定结果显示肝细胞纯度高,冻存复苏培养的细胞活度良好,可检测到IL-10/IL-10R1mRNA和IL-10蛋白的表达。细胞周期检测发现,冻存培养的原代肝细胞细胞周期高度同步化;MTT检测显示IL-10干预48 h,I组吸光度值分别为C组的88.41%（P<0.05）;台盼兰细胞计数亦提示IL-10干预48 h, I组平均细胞数仅为C组的71.96%（P<0.05）;流式细胞周期检测结果表明,IL-10干预24 h,I组平均细胞DNA含量是C组的59.06%,I组较C组降低（P<0.01）,甚至低于正常组（P<0.01）;AO-EB法、AnnexinV法检测细胞凋亡显示原代培养肝细胞凋亡数量较少。半定量RT-PCR检测原代肝细胞生长因子中,仅IGF-1 mRNA呈稳定高表达,培养至24h、48h,I组IGF-1相对含量分别为C组的87.38%、89.43%,差别显著（P<0.01）。结论:肝细胞可自分泌IL-10,肝纤维化大鼠肝组织IL-10mRNA表达降低,外源性IL-10抑制肝纤维化大鼠肝细胞凋亡。冻存使原代肝细胞发生同步化作用;外源性IL-10抑制原代肝细胞的增殖,并抑制其IGF-1的表达。

论文目录

• 英文缩略词释义表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 主要材料与仪器
• 前言
• 第一部分 肝纤维化大鼠肝组织IL-10的表达变化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 原代肝细胞的分离培养
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 外源性IL-10对大鼠原代肝细胞增殖凋亡的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四部分 IL-10对大鼠原代肝细胞IGF-1等生长因子表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述：IL-10受体研究进展
• 致谢