论文摘要
中药药效物质基础的研究不仅要求对其中指标性成分进行精确的含量测定,还需对其中所含各类化学成分进行鉴别,从而达到整体全面地控制与评价中药质量。中药药效成分的研究不仅要求对其本身所含化学成分进行区分鉴别,还需对其入血成分进行分析测定,确定可能的药效成分,同时进一步对其体内代谢过程和作用机理进行研究,结合中药方证模型和药理指标来评价药效,最终确定中药方证相关的有效成分。中药成分分析研究的复杂性与整体性,决定了单靠一种类型的分析技术并不能满足中药分析的要求,所以必须考虑采用多种联用分析技术进行综合分析,发挥各种联用技术的优势。本论文基于现代联用分析技术,以五味子和白芷两味中药为研究对象,从体内外成分分析入手,建立了一套用于中药体内外成分鉴别与药效成分初步筛选的方法与模式,并将这些方法及相关技术应用于中药全面质量控制与体内多成分药代动力学研究中。在此基础上,根据目的不同分别比较了各联用分析技术在体内外成分分析中的优缺点。针对中药成分分析的要求,发展建立了综合HPLC-DAD,HPLC-MS,HPLC-TOF/MS,HPLC-QIT/MS,GC-MS共同用于中药复杂成分快速分析鉴别的方法与研究模式。以五味子中木脂素类成分和白芷中香豆素类成分为分析对象,综合HPLC-DAD.HPLC-TOF/MS,HPLC-QIT/MS三种联用分析技术对中药体内外所含主要化学成分进行了分析鉴别,对主要化学成分的质谱碎裂规律进行了初步解析。实验中分别对五味子药材的提取条件进行了系统优化,以五味子药材中已有的六个对照品为指标,系统考察了影响五味子药材提取效率的各个因素,包括提取时间,提取溶剂,提取次数等,最终确定采用甲醇超声提取30 min作为提取条件。HPLC-DAD色谱图显示各色谱峰均实现良好分离;借助HPLC-TOF/MS对五味子中21个化学成分进行了初步定性。然后利用离子阱技术对六个木脂素类成分对照品进行了多级裂解分析,各木脂素类成分的多级裂解具有共同的规律可循:木脂素类成分的化学结构具有共同的结构母核,区别仅在于连接在其结构母核上的基团不同,从木脂素类成分的化学结构上看,大多数木脂素类成分其结构母核上的连接基团为-CH3,-OH,-OCH3等,这使得木脂素类成分在进行碎片裂解时,容易形成[M+H-15]+,[M+H-18]+,[M+H-31]+的碎片离子。如果在木脂素类成分结构母核的C-7位上连接有-OH基团,由于连接-OH的相邻C均为饱和烃形式,因此其很容易失去一分子水形成双键。脱水后在C-7和C-8形成双键。在系统总结五味子中木脂素类成分裂解规律的基础上,对五味子中三组同分异构体化合物通过多级碎片裂解分析进行了区分鉴别。香豆素与木脂素类成分同属于苯丙素类成分。同样,综合三种技术共同应用于中药白芷中香豆素类成分的鉴别与结构解析。采用HPLC-TOF/MS对白芷中15个主要香豆素类成分进行了初步鉴别,然后利用离子阱技术对两个香豆素类成分对照品进行了多级裂解分析,香豆素类成分的多级裂解具有共同的规律可循:香豆素类成分的呋喃香豆素结构母核相对稳定,所以在对其进行碰撞诱导裂解时,首先脱去连接在呋喃香豆素结构母核上的单氧取代结构基团,使结构母核上的氧转生成羰基,进行碰撞诱导裂解时,根据其连接基团不同,所形成的碎片离子也各不相同。如果在呋喃香豆素结构母核的C-5位连接基团,则容易形成[M+H-R-44]+的碎片离子,[M+H-R-44]+的碎片离子的信号强度要高于[M+H-R-28]-;如果在C-8位连接基团,则容易形成[M+H-28]-的碎片离子,[M+H-R-28]+的碎片离子要比[M+H-R-44]-的信号强。如果烷氧取代基在C-5和C-8同时存在,它的碎片峰则只有脱去CO的而没有脱去CO2的。在此基础上,采用HPLC-QIT/MS对白芷中三组同分异构体,通过多级碎片裂解分析进行了区分鉴别。采用GC-MS分析技术,对五味子中挥发油成分进行了分析鉴别与定性研究,由于GC-MS联用仪配有EI离子源,EI离子源所得质谱图具有重现性高,有相应的化学成分数据库等特点,可借助计算机检索与质谱数据库自动匹配进行鉴别分析,实验中共成功鉴别出五味子中47个挥发油成分。在对中药材化学成分分析鉴别的基础上,通过给SD大鼠灌胃给药五味子提取物,综合三种联用技术,对比体外五味子药材化学成分峰,对大鼠血浆中成分进行分析鉴别,共成功鉴别出大鼠血浆中11个木脂素类原型成分,并建立了中药体内吸收成分指纹图谱。在系统考察了色谱条件和样品前处理方法的基础上,建立了采用HPLC法同时测定五味子中六个木脂素类成分的含量测定方法;并对该方法进行了系统的方法学验证,方法学验证结果表明该含量测定方法可用于五味子中六个木脂素类成分的含量测定。将该方法应用于33个不同产地和批次的五味子药材和5个含有五味子药材的中药复方制剂中六个木脂素类成分的含量测定。结果表明,不同产地的五味子药材中六个木脂素类成分的含量差别很大,以六个木脂素类成分的总含量计,东北三省的总木脂素类成分的含量较高,其中吉林五味子中总木脂素类成分的含量最高。采用HPLC-MS方法测定五味子中六个木脂素类成分的含量,所建立含量测定方法简便可靠,血浆中内源性物质均不干扰样品峰,方法学验证结果表明该含量测定方法适合于生物样品中六个木脂素类成分的含量测定。该方法成功应用于SD大鼠单剂量口服给药五味子提取物和混悬液和五味子甲素混悬液后的药代动力学研究。单剂量口服给药五味子提取物混悬液和五味子甲素混悬液后,大鼠体内六个木脂素类成分的血药浓度个体差异较大。实验结果表明五味子提取物中五味子甲素、对照品甲素二者药-时曲线图,除提取物有一个二次吸收峰外,其余部分大致相近,但药动学参数并不一致,五味子甲素单体从吸收到消除历程较提取物中甲素快,单体甲素历时24h,提取物中甲素历时48h。单体甲素的T1/2、Cmax、AUC、MRT、Vss等参数均小于提取物中甲素,但C1/F值大于后者。这表明五味子甲素单体快于五味子提取中甲素的吸收和代谢速度。灌胃给药五味子提取物后,五味子中其它木脂素类成分的药-时曲线成双峰,这可能与肠肝循环有关,醇甲、酯甲、乙素的药动学参数中Tmax明显大于其它木脂素类成分,显示吸收和代谢慢于其它三个成分。五味子提取物灌胃给药后药代动力学结果提示,中药提取物混合给药的药效作用增强,显示中药中化学成分协同配伍作用的内涵。采用现代联用分析技术对中药体内外化学成分进行指标性化学成分含量测定与主要化学成分快速鉴别的结果表明:含量测定方面,各种现代联用分析技术在检测灵敏度方面:HPLC-MS＞HPLC-TOF/MS＞HPLC-DAD。在化学成分快速鉴别方面,分别比较HPLC-DAD、HPLC-TOF/MS、HPLC-QIT-MS三种联用分析技术,HPLC-DAD可根据化合物特征性紫外吸收和保留时间进行定性鉴别;HPLC-TOF/MS可利用精确质量测定和可能分子式匹配对中药化学成分进行初步定性鉴别;HPLC-QIT/MS可利用各化合物的多级碎片结构对相应化学成分进行结构解析,从而鉴别区分HPLC-TOF/MS无法区分的同分异构体化合物。比较各种联用分析技术在体内外不同类化学成分分析中的优缺点,可为选择最佳的分析技术,发挥现代分析技术在中药分析中的利用率提供帮助。
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