论文摘要
吉非替尼（Gefitinib）是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFRTKI）类靶向药物,目前主要用于治疗已接受过铂类为基础化疗的非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）进展期患者[1]。多个研究已证实,吉非替尼对于不吸烟的腺癌患者高度敏感,且其具有不良反应小、疗效和化疗相似、患者依从性好等特点,因此有学者建议,对于不吸烟或少吸烟的高龄腺癌女性,同时伴有EGFR突变的患者可考虑作为一线治疗方案。然而,靶向药物同样存在着原发耐药和继发耐药的问题,目前关于继发耐药的机制主要有:二次突变学说[2-3]、非T790M继发突变[4-6]等,但亦有研究显示吉非替尼的耐药与药物的转运、EGFR基因的扩增[7]以及信号通路的改变[8-9]有关,非单一机制能完全解释其耐药性。洛伐他汀（Lovastatin）是一种3-羟基-3-甲基辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂,国外已相继有研究证实洛伐他汀可以抑制EGFR/K-Ras以及下游的Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT通路的活性[10]。目前关于出现吉非替尼耐药的NSCLC选择何种下一步的治疗仍无定论。国外有研究证实在体外实验中,洛伐他汀可诱导伴有K-ras突变吉非替尼耐药的细胞株的细胞凋亡[11],目前国内关于洛伐他汀是否可以克服吉非替尼耐药尚无相关文献报道。本实验旨在验证应用洛伐他汀与吉非替尼的联合是否可克服吉非替尼耐药的问题,并探讨其可能的机制。方法耐吉非替尼的人NSCLC细胞株PC9[12]由同济大学附属上海市肺科医院周彩存教授惠赠,已经验证其耐药性在无药培养基中可维持1年以上。实验按照不同处理方法分为:（1）正常对照组:（2）吉非替尼处理组:稀释后吉非替尼终浓度为:1μmmol/L;（3）洛伐他汀处理组:稀释后洛伐他汀终浓度为:5μmmol/L;（4）吉非替尼联合洛伐他汀处理组:稀释后吉非替尼和洛伐他汀终浓度分别为:1μmmol/L、5μmmol/L。采用WST-1检测不同药物处理组对PC9细胞增殖的影响。Hoechst33342荧光染色显微镜观察法观察细胞凋亡形态,流式细胞技术观察细胞凋亡状况,Western blot检测相关信号通路蛋白的表达变化。结果在人NSCLC耐吉非替尼细胞株PC9中,与单独使用吉非替尼相比,联合洛伐他汀和吉非替尼显示出显著地促进细胞增长的抑制和杀伤作用,经Hoechst 33342染色液染色的各组细胞在倒置相差显微镜下显示两药联合组细胞形态不规则,可见细胞核固缩、碎裂,可见较多漂死细胞。WST-1法检测提示两药联合对耐吉非替尼的PC9细胞的增殖的抑制作用较单用吉非替尼增加。流式细胞仪技术检测结果显示:空白对照组耐吉非替尼的PC9细胞凋亡率为2.5%,吉非替尼组(和洛伐他汀组细胞凋亡率分别为5.5%和9.4%,两药联合组凋亡率为65.5%。两药联合组与空白对照组两者比较有统计学意义（P<0.01）;两药联合组与单用吉非替尼或者洛伐他汀比较有统计学意义（P<0.01）,表明洛伐他汀具有明显的诱导耐吉非替尼的PC9细胞凋亡的作用。通过Western blot检测到洛伐他汀、吉非替尼联合处理组的p-EGFR、p-AKT、p-ERK较对照组明显下降。结论在体外诱导吉非替尼获得性耐药的NSCLC细胞株PC9中,洛伐他汀可以克服吉非替尼耐药,两者具有良好的协同作用,提示两药联合对于出现吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的临床治疗可能具有很大的潜力。