银杏叶提取物对大鼠视网膜神经节细胞凋亡及L-型钙通道电流影响的实验研究

论文摘要

目的：1.建立银杏叶提取物对体外混合培养大鼠视网膜神经细胞（Retinal Neuronal Cells, RNCs）及纯化后的大鼠视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGCs）保护作用有效浓度的筛选方法。2.观察银杏叶提取物（Ginkgo biloba Extract,GBE）对体外纯化培养大鼠视网膜神经节凋亡的影响,探讨其神经保护的作用机制。3.观察银杏叶提取物对急性分离的大鼠视网膜神经节细胞L-型钙离子通道电流的影响,探讨其作用机理,在细胞分子水平为进一步开发银杏叶提取物在眼科视网膜领域的保护作用提供理论依据。方法：1.建立体外混合培养大鼠视网膜神经细胞模型及经纯化后的大鼠视网膜神经节细胞模型。2.应用MTT比色法,筛选银杏叶提取物对体外培养3天后的RNCs和培养2天后RGCs保护作用的有效浓度。3.将体外培养的大鼠视网膜神经节细胞分为银杏叶提取物高、中、低剂量组（500ug/ml、100ug/ml、10ug/ml）、50ng/ml脑源性神经营养因子（Brain-derived Neurotrophic Factor, BDNF）组,空白对照组。纯化的RGCs培养2天后,各组分别加入相应剂量的银杏叶提取物和脑源性神经营养因子,使各组在培养液中的终浓度分别为500μg/ml GBE、100μg/ml GBE、10μg/ml GBE、50ng/ml BDNF。24h后收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。4.通过木瓜蛋白酶酶解,结合机械吹打制备分离的单个大鼠视网膜神经细胞,建立急性分离的大鼠视网膜神经节细胞模型。5.应用膜片钳技术,在全细胞膜片钳记录模式下,记录各浓度银杏叶提取物（500μg/ml、100μg/ml、10μg/ml GBE、1μg/ml、0.1μg/ml）对L-型钙离子通道电流的影响。结果：1.MTT比色法对RNCs保护作用有效浓度进行筛选,1000μg/ml、500μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/mlGBE,50ng/mlBDNF各组及空白对照组的OD值分别为（0.57±0.09,0.74±0.10,0.74±0.12,0.57±0.07,0.58±0.10,0.46±0.10,0.34±0.07,0.81±0.06,0.35±0.06）。1000μg/ml、500μg/ml 100μg/ml 10μg/ml 1μg/ml 0.1μg/ml GBE各组和50ng/ml BDNF组与空白对照组比较,差别有统计学意义（P<0.01）。2.MTT比色法对RGCs保护作用有效浓度进行筛选,1000μg/mlGBE、500μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.001μg/ml GBE,50ng/ml BDNF各组与空白对照组的OD值分别为（0.72±0.03,0.52±0.09,0.43±0.11,0.32±0.03,0.32±0.04,0.30±0.05,0.28±0.05,0.78±0.08,0.25±0.04）。1000μg/ml、500μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/mlGBE各组和50ng/ml BDNF组与空白对照组比较,差别有统计学意义（P<0.01）。3.流式细胞仪检测RGCs凋亡,银杏叶提取物高、中、低剂量组（500ug/ml、100ug/ml、10ug/ml）,50ng/mlBDNF组,空白对照组细胞凋亡率（%）分别为（0.42±0.10,0.32±0.12,0.53±0.13,0.51±O.14,12.15±1.98）,高、中、低剂量组和50ng/ml BDNF与空白对照组比较,差别有统计学意义（P<0.01）。4.在施加各浓度（0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、银杏叶提取物后,归一化的大鼠视网膜神经节细胞L-型钙离子通道电流压抑到对照电流（自身加药前）的（101.22±18.74）%,（91.13±5.03）%,（7.53±30.53）%,32.26±15.13）%, （6.13±6.77）%。1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml银杏叶提取物在加药前后对大鼠视网膜神经节细胞L-型钙离子通道电流的影响,差别有统计学意义（P〈0.01）; GBE各浓度间对大鼠视网膜神经节细胞L-型钙离子通道电流的影响,差别有统计学意义（P<0.01）。结论：1.银杏叶提取物对体外混合培养大鼠视网膜神经细胞保护作用有效浓度为0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml。2.银杏叶提取物对纯化后的大鼠视网膜神经节细胞保护作用有效浓度为1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml。3高、中、低剂量的银杏叶提取物对纯化后的大鼠视网膜神经节细胞的凋亡都有抑制作用,其中中剂量（100μg/ml）组的抑制凋亡的效果较显著。4.1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml银杏叶提取物对大鼠视网膜神经节细胞L-型钙离子通道电流有压抑作用,呈现浓度依赖性。5.银杏叶提取物对大鼠视网膜神经节细胞的保护作用,可能是通过压抑钙离子内流,进而抑制细胞的凋亡实现的。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 引言
• 2 正文
• 2.1 实验一 筛选银杏叶提取物对体外混合培养大鼠视网膜神经细胞保护作用有效浓度的研究
• 2.1.1 体外混合培养大鼠视网膜神经细胞模型的建立
• 2.1.1.1 实验材料
• 2.1.1.2 实验方法
• 2.1.1.3 实验结果
• 2.1.2 不同浓度银杏叶提取物对体外混合培养大鼠视网膜神经细胞的影响
• 2.1.2.1 实验材料
• 2.1.2.2 实验方法
• 2.1.2.3 统计方法
• 2.1.2.4 实验结果
• 2.1.3 小结
• 2.2 实验二 筛选银杏叶提取物对体外纯化培养大鼠视网膜神经节细胞保护作用有效浓度的研究
• 2.2.1 体外纯化培养大鼠视网膜神经细胞节模型的建立
• 2.2.1.1 实验材料
• 2.2.1.2 实验方法
• 2.2.1.3 实验结果
• 2.2.2 不同浓度银杏叶提取物对体外纯化培养大鼠视网膜神经节的影响
• 2.2.2.1 实验材料
• 2.2.2.2 实验方法
• 2.2.2.3 统计方法
• 2.2.2.4 实验结果
• 2.2.3 小结
• 2.3 实验三银杏叶提取物对体外纯化培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡影响的研究
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.1.1 实验动物
• 2.3.1.2 实验试剂
• 2.3.1.3 实验仪器
• 2.3.1.4 培养瓶（培养板）及盖玻片的铺板处理
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.2.1 大鼠视网膜神经节细胞的体外纯化培养
• 2.3.2.2 大鼠视网膜神经节细胞的鉴定
• 2.3.2.3 凋亡检测的分组方法
• 2.3.2.4 银杏叶提取物对体外纯化培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡的检测
• 2.3.3 统计方法
• 2.3.4 实验结果
• 2.3.5 小结
• 2.4 实验四 银杏叶提取物对急性分离大鼠视网膜神经节细胞L-型钙离子通道电流的影响
• 2.4.1 实验材料
• 2.4.1.1 实验动物
• 2.4.1.2 实验试剂及相关试剂的配制方法
• 2.4.1.3 实验仪器及相关软件
• 2.4.2 实验方法
• 2.4.2.1 急性分离大鼠视网膜神经细胞
• 2.4.2.2 银杏叶提取物对急性分离的大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流影响的全细胞膜片钳记录
• 2.4.2.3 加药系统
• 2.4.2.4 急性分离大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流记录的刺激方案
• 2.4.2.5 急性分离大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流鉴定的刺激方案
• 2.4.2.6 银杏叶提取物对急性分离大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流影响的刺激方案
• 2.4.3 数据处理及统计方法
• 2.4.4 实验结果
• 2.4.4.1 急性分离大鼠视网膜神经节细胞形态特征
• 2.4.4.2 急性分离大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流的鉴定
• 2.4.4.3 急性分离大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流的记录结果
• 2.4.4.4 银杏叶提取物对急性分离大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流的影响
• 2.4.5 小结
• 3. 讨论
• 3.1 银杏叶及其提取物对视功能保护作用的认识
• 3.2 银杏叶提取物对体外RNCs和RGCs保护作用有效浓度的探讨
• 3.3 银杏叶提取物对体外培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响
• 3.4 银杏叶提取物对大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流压抑作用的探讨
• 3.4.1 生理条件下细胞内钙离子稳态
• 2+超载'>3.4.2 Ca²⁺超载
• 3.4.3 不同浓度银杏叶提取物对的大鼠视网膜神经节细胞L-型钙通道电流的影响
• 3.5 膜片钳技术运用于中医药研究的价值
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述1
• 参考文献
• 综述2
• 参考文献
• 综述3
• 参考文献
• 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果