禽波氏杆菌外膜蛋白的提取及免疫原性的研究

论文摘要

禽波氏杆菌病是由禽波氏杆菌（Bordetella avium）引起家禽的一种高度接触性传染病。我国最早是由朱瑞良等在1990年初发现的,该病主要引起鸡胚死亡、孵化率降低和雏鸡急性死亡及成年鸡的眼炎等。据报道该病在不同地区的感染率为10%～50%,患病鸡群生长迟缓,饲料报酬低,给养鸡业造成了较大的经济损失。近年来,细菌细胞膜中的一种重要组成成分外膜蛋白（outer-membrane-protein,OMP）的免疫作用越来越受到科技人员的关注,并进行了研究。实验证明,OMP具有良好的免疫原性,不仅可刺激体液免疫,而且也可刺激细胞免疫作用。尽管我们课题组曾经研究过禽波氏杆菌全菌苗的免疫效果,但由于全菌中与免疫无关的成分太多,可能影响主要免疫物质的免疫作用,所以我们进行了禽波氏杆菌OMP的提取工艺及其免疫原性的研究,这为进一步开发禽波氏杆菌OMP亚单位疫苗奠定了基础。现将研究情况报告如下:试验一:间接ELISA检测禽波氏杆菌抗体方法的建立及临床应用首次建立了用禽波氏杆菌外膜蛋白作为包被抗原,检测禽波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。试验的最佳反应条件为:抗原的稀释度为1:160（此时蛋白浓度为15μg/mL）;血清稀释度为1:200;酶标二抗稀释度为1:4000;用磷酸盐缓冲液（0.01mol/L,pH7.4）作包被液;选择含1%BSA的PBST作封闭液和稀释液;4℃、24h包被;37℃、3h封闭;血清反应时间为60min;酶标抗体反应时间为45min;底物反应时间为20min。应用该方法检测禽波氏杆菌阳性血清,其灵敏度为平板凝集试验的200-400倍;应用该方法临床上进行血清学调查,其灵敏度为平板凝集试验的3-4倍,而且还具有良好的稳定性和可重复性,较高的特异性和敏感性,操作简便,快速等特点。试验二:禽波氏杆菌外膜蛋白提取及免疫原性的检测为研究禽波氏杆菌OMP的免疫原性,本试验采用超声波破碎、十二烷酰肌氨酸处理技术提取了禽波氏杆菌OMP,采用Bradford方法测定禽波氏杆菌OMP含量,进行了SDS-PAGE电泳检测,然后制备油乳剂OMP免疫抗原,对1日龄雏鸡分别以0.3mL（OMP90μg）、0.5mL（OMP150μg）、0.8mL（OMP240μg）的剂量颈部皮下接种。结果:禽波氏杆菌OMP含量为300μg/mL;禽波氏杆菌OMP最佳免疫剂量为0.5mL/只;通过免疫抗体与攻毒保护相关性测试,抗体效价在1:28以上能抵抗致死量禽波氏杆菌的攻击。据间接ELISA法检测的抗体水平可知,抗体的持续时间足以保护雏鸡避过易感日龄,试验发现OMP具有良好的免疫原性。本试验结果将为禽波氏杆菌OMP单克隆抗体的制备、快速诊断试剂盒的研制、亚单位疫苗的开发奠定良好的基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1. 禽波氏杆菌病的研究现状
• 1.1 病原学
• 1.2 流行病学
• 1.3 临诊症状和病理变化
• 1.4 感染过程地发病机理
• 1.5 禽波氏杆菌的致病性
• 1.6 与禽波氏杆菌致病性相关基因
• 1.7 禽波氏杆菌的诊断
• 1.8 禽波氏杆菌病的防制
• 1.9 经济意义及公共卫生意义
• 2 细菌外膜蛋白的研究现状
• 2.1 OMP 的生理功能
• 2.2 OMP 的免疫原性
• 2.3 OMP 的致病作用
• 2.4 外膜蛋白与血清型
• 3. 本研究的内容、目的及意义
• 试验一：间接 ELISA检测禽波氏杆菌抗体方法的建立及临床应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验用菌株
• 1.1.2 试验仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 参考血清
• 1.1.5 试验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 间接ELISA 抗原的制备
• 1.2.2 禽波氏杆菌外膜蛋白免疫血清和阴性血清的制备
• 1.2.3 间接ELISA 操作程序
• 1.2.4 间接ELISA 最佳反应条件的选择
• 1.2.5 特异性试验和敏感性试验
• 1.2.6 ELISA 的重复性
• 1.2.7 间接 ELISA 的临床应用
• 2. 结果
• 2.1 间接ELISA 方法最佳反应条件的建立
• 2.1.1 抗原包被和待检血清最适稀释倍数的测定
• 2.1.2 酶标抗体稀释浓度的选择
• 2.1.3 包被液的选择
• 2.1.4 封闭液的选择
• 2.1.5 抗原包被和封闭条件的选择
• 2.1.6 稀释液的选择
• 2.1.7 待检血清作用时间的选择
• 2.1.8 酶标抗体作用时间的选择
• 2.1.9 底物最佳反应时间的选择
• 2.1.10 临界值确定
• 2.2 特异性试验
• 2.3 阻断性试验
• 2.4 间接ELISA 和微量凝集试验敏感性比较实验
• 2.5 重复性试验
• 2.6 临床应用
• 3. 讨论与小结
• 试验二：禽波氏杆菌外膜蛋白的提取及其免疫原性的检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 实验菌株
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 化学试剂
• 1.1.5 电泳所用试剂
• 1.1.6 兔抗鸡酶标抗体
• 1.1.7 试验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 禽波氏杆菌OMP 提取流程
• 1.2.2 禽波氏杆菌OMP 蛋白含量测定
• 1.2.3 禽波氏杆菌SDS-PAGE 电泳检测
• 1.2.4 禽波氏杆菌外膜蛋白提取条件的优化
• 1.2.5 兔抗禽波氏杆菌OMP 免疫血清的制备
• 1.2.6 禽波氏杆菌 OMP 免疫保护效力的检测
• 2. 结果
• 2.1 禽波氏杆菌 OMP 含量测定
• 2.2 禽波氏杆菌 OMP 的SDS-PAGE 电泳
• 2.3 禽波氏杆菌外膜蛋白提取条件的优化
• 2.4 禽波氏杆菌 OMP 免疫保护效力的检测结果
• 2.4.1 间接 ELISA 法检测抗体效价
• 2.4.2 禽波氏杆菌 OMP 免疫保护抗体临界点的确定
• 3.小结与讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附图