论文摘要
背景与目的顺铂是一类广泛应用于临床肿瘤治疗的细胞毒性药物,其肾毒性和耳毒性副作用严重影响患者生活质量,随着肿瘤耐药现象的出现,顺铂的化疗用量逐渐加大,毒副作用也愈加明显,由于化疗前水化和利尿剂的使用,肾毒性副作用已得到有效预防,因而对其耳毒性的防治成为一项亟待解决的课题。国内外尝试用药物保护受损的内耳细胞,但由于血迷路屏障的存在,药物到达内耳的有效浓度不高,疗效受限,新的防治方法亟待探索。随着分子生物学的发展,通过将特异性基因转入内耳细胞中持久表达以拮抗顺铂的毒性作用,取得较好效果,基因治疗已成为目前研究的热点。位于耳蜗外侧壁的螺旋韧带因为由间质细胞构成一直未受到重视,近年研究发现,螺旋韧带参与构成血迷路屏障,是内耳钾离子循环的枢纽,表达多种基因,如Cx26, Cx30, Cx31, Cx43, COCH以及Pendrin等,这些基因的异常可以导致听力损失,因此螺旋韧带的功能在耳科学研究中逐步成为热点。Otos是一种新发现的特异性表达于螺旋韧带成纤维细胞（Spiral Ligament Fibrocytes, SLFs）上的特殊基因,它的表达缺失可以导致耳聋,推测它可能具有保护螺旋韧带成纤维细胞和维护耳蜗内环境稳定的作用。但Otos在顺铂耳毒性病理过程中的作用和机制尚不清楚,本研究拟通过上调SLFs的Otos表达,探测Otos对SLFs顺铂损伤的保护作用及相关机制。研究方法1、原位杂交法检测大鼠耳蜗Otos mRNA的表达。2、大鼠SLFs的原代培养和SLFs类型的免疫荧光鉴定。3、设计和构建表达大鼠Otos的腺病毒表达载体。应用RT- PCR技术由体外培养的大鼠SLFs总RNA中克隆出Otos基因,将Otos基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后,转染293细胞进行包装,并反复感染293细胞进行扩增,对其进行滴度及活性等检测。4、用构建好的腺病毒载体转染培养的SLFs,确定其最佳感染复数（Multiplicity ofinfection,MOI）和感染时间。5、用腺病毒载体的最佳感染复数和感染时间感染SLFs后,将细胞分两大组,每组含3种细胞,即SLFs-AdOtos（含GFP）、SLFs-AdGFP和SLFs-nontransfection,两个大组分别用20μM顺铂或DMEM作用12h后,用MTT和TUNEL法分别检测细胞活力和凋亡情况,用RT-PCR检测Otos mRNA的表达,免疫印迹检测JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、bcl-2、bax、caspase-3蛋白的表达。6、将Ad-Otos转染的SLFs分5组,其中3组分别用JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂PD98059、p38抑制剂SB203580预处理后,用20μM顺铂作用细胞,另2组分别用20μM顺铂或DMEM处理作为对照,MTT和TUNEL法分别检测细胞活力和凋亡情况,免疫印迹检测bcl-2、bax和caspase-3的蛋白表达。结果1、原位杂交法显示大鼠耳蜗螺旋韧带上有Otos mRNA的表达。2、成功培养并纯化大鼠SLFs,免疫荧光鉴定为Ⅰ型SLFs。3、成功构建腺病毒表达载体Ad-Otos,经过293细胞大量扩增,获得病毒滴度约7×109 pfu/ml。4、经过用Ad-Otos转染培养的SLFs后,测得最适MOI为50。5、单纯转染Ad-Otos后的SLFs,其细胞活力和凋亡无明显变化,对MAPKs和线粒体凋亡途径无明显影响。6、顺铂损伤后,和对照细胞相比,转染Ad-Otos的SLFs活力增加,凋亡减少,伴有JNK途径的抑制、ERK途径的活化和线粒体凋亡途径的抑制。7、应用信号途径抑制剂,提示Otos对细胞的保护过程可能通过抑制JNK并活化ERK而实现;线粒体凋亡途径可能受MAPKs信号通路调节。结论上调Otos基因的表达对顺铂损伤的SLFs可能具有保护作用,其机制可能通过抑制JNK、活化ERK及抑制线粒体凋亡途径而实现。Otos基因上调可能成为一种针对顺铂耳毒性损伤的基因防治策略。
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相关论文文献
- [1].不同周龄小鼠耳蜗组织中Otos的表达及其意义[J]. 吉林大学学报(医学版) 2019(06)
标签：腺病毒论文; 转染论文; 螺旋韧带论文; 成纤维细胞论文; 顺铂论文; 凋亡论文; 信号途径论文; 线粒体途径论文;