纤维素的改性及其用于生物大分子分离的研究

论文摘要

毛细管电泳是一种分析DNA和蛋白质等带电生物大分子最有效、最广泛的技术之一。与传统凝胶电泳相比,它具有高效、微量、高灵敏度及易于自动化的特征。毛细管电泳的核心部件是毛细管电泳柱,虽然用未经处理的石英毛细管电泳柱可以进行多种样品的分离,但是要有效地分离生物大分子,如蛋白质和DNA,只用未经处理的毛细管电泳柱就难以奏效了,解决问题的有效办法之一就是对毛细管电泳柱进行涂覆。对毛细管进行涂覆的主要目的有:减少被分析物质与毛细管内壁的相互作用;改变电渗流的影响;提高分析的重现性;满足一些特殊要求物质的分离。围绕这些内容,本文着重开展了以下几个方面的工作。1.羟乙基纤维素/聚丙烯酰胺共混物在DNA测序中的研究使羟乙基纤维素（HEC）与线形聚丙烯酰胺（LPA）共混物构成聚合物网络,并将其用于DNA的测序,这种聚合物网络同时具有LPA对DNA优良的筛分性能和HEC对毛细管内壁动态涂覆的能力。用2.5%w/v的这种介质在没有对软件系统优化的情况下,73 min内对标准DNA的读写长度可达900个碱基。2.羟乙基纤维素接枝改性聚合物在毛细管电泳分离双链DNA中的研究用于双链DNA（dsDNA）分析的理想的毛细管涂层必须具备以下特点:高的分离效能,动态涂覆功能,较低的粘度。在本文中,我们采用原子转移自由基活性聚合方法（ATRP）,合成了羟乙基纤维素接枝聚丙烯酰胺的共聚物（HEC-g-PAM）。因为作为主链的HEC具有很好的动态涂覆功能,而PAM具有良好的分离功能。通过与未涂覆的毛细管以及用HEC涂覆的毛细管的比较,证明HEC-g-PAM是一种性能优良的涂层。3.阳离子羟乙基纤维素在毛细管电泳蛋白质分离中的应用蛋白质也是一类非常重要的生物大分子。实际上,用未涂覆毛细管电泳对蛋白质进行分离很难达到好的效果。这是因为蛋白质和毛细管壁之间存在着各种不同的反应,包括:氢键结合,静电作用,憎水作用等。为了消除这些反应的影响以及达到对电渗流进行控制的目的,就必须对毛细管进行涂覆。目前,已经有多种聚合物用于这种目的,阳离子聚合物就是其中重要的一种。本文合成了阳离子羟乙基纤维素（cat-HEC）,然后利用这种聚合物涂覆的毛细管柱对蛋白质进行了分离,并与其他涂层的性能进行了比较。结果表明cat-HEC能够有效地减少碱性蛋白质在毛细管内的吸附。用该种毛细管分离蛋白质,具有分离效率高（N＞200,000 plate/m）,重复性好（RSD＜1.O%）,涂层使用时间长等优点。4.羟乙基纤维素接枝改性聚合物在毛细管电泳分离蛋白质中的应用采用了传统的Ce4+自由基引发聚合合成了HEC-g-P4VP聚合物,将这种纤维素接枝改性聚合物涂覆在毛细管内壁,研究了它在不同pH条件下对电渗流的影响。然后利用这种聚合物涂覆的毛细管柱进行碱性、中性、酸性蛋白质的分离。结果表明HEC-g-P4VP能够在毛细管内壁形成稳定的涂层,能有效地减少蛋白质在毛细管内的吸附。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 毛细管电泳的基本原理
• 1.3 毛细管电泳在 DNA分离中的应用
• 1.3.1 毛细管电泳分离 DNA的基本原理
• 1.3.1.1 高分子溶液理论
• 1.3.1.2 DNA在无胶筛分介质（高分子溶液）中的分离理论
• 1.3.1.3 DNA在缠结高分子溶液中的分离机理
• 1.3.1.4 DNA在稀溶液中的分离机理
• 1.3.1.5 分离机理与高分子溶液浓度和 DNA大小的关系
• 1.3.2 DNA筛分介质
• 1.3.2.1 均聚物
• 1.3.2.2 共聚物
• 1.3.2.3 共混聚合物
• 1.3.2.4 准互穿聚合物网络
• 1.3.2.5 微交联纳米凝胶聚合物
• 1.3.3 DNA筛分介质的研究热点
• 1.4 毛细管电泳在蛋白质分离中的应用
• 1.4.1 毛细管电泳分离蛋白质的基本原理
• 1.4.2 通过改变缓冲液pH值及组分的方法控制蛋白质吸附
• 1.4.2.1 极端pH值法
• 1.4.2.2 添加小分子添加剂
• 1.4.3 聚合物涂覆毛细管内壁抑制蛋白质吸附
• 1.4.3.1 化学键合的毛细管涂层
• 1.4.3.2 物理吸附的毛细管涂层
• 1.4.3.3 高分子材料毛细管
• 1.5 天然改性高分子的研究进展
• 1.5.1 纤维素改性高分子的合成方法
• 1.5.1.1 液相均相体系法
• 1.5.1.2 液相非均相体系法
• 1.5.1.3 活性自由基聚合法
• 1.5.2 纤维素改性高分子在毛细管电泳中的应用
• 1.6 论文的工作设想
• 第2章 羟乙基纤维素/聚丙烯酰胺共混物在DNA测序研究中的应用
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 实验所用试剂及提纯方法
• 2.1.1.1 主要试剂
• 2.1.1.2 试剂的提纯及缓冲溶液的配制
• 2.1.2 线形聚丙烯酰胺的合成
• 2.1.3 HEC和 LPA共混聚合物溶液的配制
• 2.1.4 聚合物的表征
• 2.1.5 DNA的测序
• 2.1.6 数据处理和分析方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 HEC含量对 DNA测序的影响
• 2.2.2 DNA测序电压设计
• 2.2.3 温度对 DNA测序分离的影响
• 2.3 小结
• 第3章 羟乙基纤维素接枝改性聚合物在毛细管电泳分离 DNA中的研究
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 实验所用试剂及提纯方法
• 3.1.1.1 主要试剂
• 3.1.1.2 试剂的提纯及缓冲溶液的配制
• 3.1.2 羟乙基纤维素接枝聚丙烯酰胺的合成
• 3.1.3 聚N，N-二甲基丙烯酰胺（PDMA）的合成
• 3.1.4 聚合物的表征
• 3.1.5 毛细管的涂覆及电渗流的测定
• 3.1.6 dsDNA的分离
• 3.1.7 数据处理和分析方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 HEC-g-PAM的合成与结构表征
• 3.2.2 毛细管的涂覆和电渗流的抑制
• 3.2.3 HEC-g-PAM水溶液的流变学特性
• 3.2.4 dsDNA的分离
• 3.2.4.1 dsDNA的选择
• 3.2.4.2 聚合物浓度对dsDNA分离的影响
• 3.2.4.3 分离电压对dsDNA分离的影响
• 3.2.4.4 HEC-g-PAM不同接枝链长度对dsDNA分离的影响
• 3.3 小结
• 第4章 阳离子羟乙基纤维素在毛细管电泳分离蛋白质中的应用
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 实验所用试剂及提纯方法
• 4.1.1.1 主要试剂
• 4.1.1.2 试剂的提纯及缓冲溶液的配制
• 4.1.2 阳离子羟乙基纤维素（cat-HEC）的制备
• 4.1.3 聚合物的表征
• 4.1.4 氮含量的测定
• 4.1.5 毛细管的涂覆及电渗流的测定
• 4.1.6 蛋白质的分离
• 4.1.7 数据处理和分析方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 Cat-HEC的合成与结构表征
• 4.2.2 毛细管的涂覆及不同pH下 EOF的抑制
• 4.2.3 Cat-HEC涂层用于碱性蛋白质的分离
• 4.2.3.1 Cat-HEC涂层浓度的选择
• 4.2.3.2 pH值的影响
• 4.2.3.3 缓冲溶液离子强度的影响
• 4.2.4 Cat-HEC涂层毛细管与空毛细管及HEC涂层毛细管的比较
• 4.2.5 涂层的稳定性
• 4.3 小结
• 第5章 羟乙基纤维素接枝改性聚合物在毛细管电泳分离蛋白质中的应用
• 5.1 实验部分
• 5.1.1 实验所用试剂及提纯方法
• 5.1.1.1 主要试剂
• 5.1.1.2 试剂的提纯及缓冲溶液的配制
• 5.1.2 HEC-g-P4VP的合成
• 5.1.3 聚合物的表征
• 5.1.4 毛细管的涂覆及电渗流的测定
• 5.1.5 蛋白质的分离
• 5.1.6 数据处理和分析方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 HEC-g-P4VP的合成与结构表征
• 5.2.2 毛细管的涂覆及不同pH下 EOF的抑制
• 5.2.3 HEC-g-P4VP用于蛋白质的分离
• 5.2.3.1 碱性蛋白质的分离
• 5.2.3.2 酸性蛋白质的分离
• 5.2.3.3 中性和碱性混合蛋白质的分离
• 5.3 小结
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果