论文摘要
背景与目的急性肺损伤（ALI）是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭,临床常见,死亡率高。内毒素是革兰阴性菌壁外膜成分,化学结构为脂多糖（LPS）,是ALI的主要致病因素之一,目前尚无有效的抗内毒素治疗药物。正常情况时人体内LPS的水平很低,即使在革兰阴性菌脓毒血症时,血浆中LPS浓度仅为0.01～1ng/ml,如此低水平LPS的致炎作用需依赖于LBP/CD14的增敏。研究发现,LBP可增强LPS对表达mCD14细胞的刺激作用,当LBP存在时LPS可刺激单核巨噬细胞产生TNF-α增加1000倍。在LPS的致炎过程中,LBP肽链的N末端与LPS结合,C末端与CD14结合。由于LBP/CD14位于LPS致炎信号通路的上游,对LPS有增敏作用,阻断经LBP/CD14的LPS信号传导,可望在各种炎性细胞激活和炎性细胞因子产生之前阻断炎症反应,减轻内毒素性ALI。为此,本研究拟运用噬菌体展示肽库筛选技术,筛选LBP与CD14结合位点的模拟肽,再行体外实验观察模拟肽的抗内毒素生物活性,并观察该模拟肽对大鼠内毒素性ALI的保护作用,以期为内毒素性ALI的防治提供实验依据和新的策略。方法1.采用噬菌体展示肽库筛选技术,对CD14进行包被,以LBP为洗脱液进行亲和筛选。再随机挑取100个筛选后噬菌体克隆,采用ELISA法逐步进行结合实验、竞争实验和细胞因子生成抑制实验,筛选出与CD14具有高亲和力、与LBP竞争性强的噬菌体克隆,并对筛选阳性噬菌体克隆进行测序,测序所得12肽与LBP一级氨基酸序列进行比对,获得模拟肽。2.应用FMOC固相法合成模拟肽,采用ELISA法检测模拟肽与CD14的结合活性及与LBP竞争性结合CD14的活力;用LPS诱导U937细胞产生TNF-α,观察模拟肽高（10μg/ml）、中（1.0μg/ml）和低（0.1μg/ml）浓度对LPS诱导细胞表达TNF-αmRNA和生成TNF-α的影响,并进一步观察不同时间应用模拟肽对LPS诱导细胞表达TNF-αmRNA和生成TNF-α的作用。3.采用颈静脉注射LPS的方法复制大鼠内毒素性ALI模型,按随机原则将实验大鼠分为正常对照组（N）、脂多糖致伤组（LPS）和模拟肽治疗组（MP12）。大鼠按分组进行不同处理, 2 h后,测定动脉血氧分压（PaO2）和肺组织湿干重比（W/D）,采用伊文思蓝示踪法检测肺微血管通透性,并进行肺组织病理形态学观察;再行支气管肺泡灌洗分离肺泡巨噬细胞,观察模拟肽对肺泡巨噬细胞结合LPS的影响。结果1.噬菌体展示肽库的亲和筛选使噬菌体得到了有效富集,结合实验显示100个噬菌体克隆中73个与CD14有较高的结合活性,竞争抑制实验表明26个克隆具有较强与LBP竞争结合CD14的活性;细胞因子生成抑制实验显示,26个噬菌体克隆中8个可显著抑制LPS诱导细胞生成TNF-α。2.对8个筛选阳性的噬菌体克隆进行测序,获得3条12肽序列FHRWPTWPLPSP,AAFHRAHHLTSP和MHRHPPPITLPL,其核心序列为共同序列FHRXPXXXXPXX,Blast检测3条多肽与LBP一级结构无相似的序列,为模拟肽;3.应用FMOC固相合成法成功合成模拟肽AC-FHRWPTWPLPSP-NH2,纯度在95%以上,分子量为1562.00,与理论值相符。结合实验显示,模拟肽在高、中浓度时与CD14有较高的结合活性;竞争抑制实验显示,模拟肽在高、中浓度时有较强的与LBP竞争结合CD14的活力。4.LPS组细胞TNF-α基因和蛋白表达较对照组显著增高（P﹤0.01）,模拟肽高、中浓度组TNF-α比LPS组明显降低（P﹤0.05）;不同时间应用模拟肽对LPS诱导细胞TNF-α影响实验结果显示,早期应用模拟肽干预可抑制LPS诱导细胞TNF-α的表达。5.与正常对照组比较,LPS致伤组大鼠的PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增强和肺泡巨噬细胞平均荧光强度增加（P﹤0.05）;模拟肽治疗组上述指标较LPS组有明显改善（P﹤0.05）。结论1.本研究成功的从噬菌体展示肽库中筛选获得了与CD14有高亲和力、抑制LBP结合CD14活性强、可明显降低LPS诱导细胞生成TNF-α的噬菌体克隆。2.测序获得了噬菌体克隆展示肽序列FHRWPTWPLPSP、AAFHRAHHLTSP和MHRHPPPITLPL,其核心序列为FHRXPXXXXPXX,多肽与LBP一级结构无相似的序列,为模拟肽。3.模拟肽AC-FHRWPTWPLPSP-NH2具有与CD14亲和力高,抑制LBP结合CD14活性强的生物特性。4.模拟肽能够在基因和蛋白水平抑制LPS诱导单核巨噬细胞TNF-α的表达,其早期应用对TNF-α的抑制作用明显。5.模拟肽可改善内毒素性ALI大鼠的氧合,减轻肺损伤,其减少大鼠肺泡巨噬细胞与LPS的结合可能是对大鼠内毒素性ALI保护作用的机制之一。
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