论文摘要
白血病是一种克隆性起源,多能干细胞或早期的祖细胞（髓系或淋系）突变而引起的造血系统恶性肿瘤。白血病细胞恶性增殖,进入血循环、并浸润全身各组织脏器;临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛等浸润症状。目前白血病已经成为我国最常见恶性肿瘤之一,发病率在各种肿瘤中占第六位,而且在年轻人恶性疾病中排名首位。尽管通过传统细胞毒药物联合化疗、维甲酸和砷剂诱导分化治疗、造血干细胞移植和支持治疗等综合方法,已经使急性白血病的完全缓解率达到70-90%,3年无病生存率达40-50%。但仍存在化疗相关毒性、化疗药物的非选择性以及对复发难治白血病的耐药性等诸多问题,促使研究者致力于研究各种新型的、更具靶向性的治疗手段,而基因病毒治疗正是其中新兴的一个研究方向。溶癌腺病毒在肿瘤细胞中复制后可以溶解细胞,并释放出子代病毒颗粒,进一步感染周边的肿瘤细胞,直至完全消灭肿瘤。本研究中,我们构建新型溶癌腺病毒,具有5型和35型嵌合纤毛或5型和11型嵌合纤毛,并且E1B-55kDa缺失,同时可以携带TRAIL或自噬相关基因BECN等效应基因,从而达到基因治疗与病毒治疗相结合的策略。此外,我们进一步设计和研究化疗、基因治疗和病毒治疗三种手段相结合杀伤白血病细胞这一新思路,以期为临床白血病治疗提供新的方法和策略。本研究分三部分进行:第一部分:溶癌腺病毒SG235-TRAIL抗白血病细胞的体内外研究;第二部分:溶癌腺病毒SG235-TRAIL协同高三尖杉酯碱杀伤白血病细胞的研究;第三部分:溶癌腺病毒SG511-BECN抗白血病细胞的体内外研究。第一部分:溶癌腺病毒SG235-TRAIL抗白血病细胞的体内外研究目的:构建新型溶癌腺病毒SG235,其具有5型和35型嵌合纤毛并且E1B-55kDa缺失,同时可以携带TRAIL表达框;通过体内外实验证实和比较SG235及SG235-TRAIL抗白血病细胞效应,并探讨其作用机制。从而为白血病靶向治疗提供基因治疗和病毒治疗相结合的手段。方法:构建新型溶癌腺病毒SG235、SG235-增强绿色荧光蛋白（enhanced greenfluorescence protein,EGFP）以及SG235-TRAIL,通过荧光倒置显微镜、流式细胞术、病毒滴度检测和western blot法检测E1A的手段,来研究SG235对白血病细胞株、淋巴瘤细胞株、多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）细胞株、患者原代白血病细胞和白血病细胞集落（leukemic colony forming unit,CFU-L）的感染能力及其复制活性;通过western blot法来明确SG235 E1B-55kDa是否缺失;通过四甲基偶氮唑蓝（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphemyltetra-zolium bromide,MTT）法检测各型腺病毒对白血病细胞株的细胞毒作用;通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphate in situ nick end labeling,TUNEL）法和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）转位法来证实SG235、SG235-TRAIL诱导白血病细胞株和患者原代白血病细胞发生凋亡;通过罗丹明123（rhodamine 123,Rh123）染色法来检测SG235-TRAIL感染白血病细胞株后线粒体膜电位改变;采用western blot法来检测各型腺病毒感染白血病细胞株和患者原代白血病细胞后Caspase家族蛋白、B细胞白血病/淋巴瘤因子-2（B cell leukemia/lymphoma,Bcl-2）家族蛋白的改变,并进一步加用Caspase-3抑制剂（z-DEVD-FMK）和Caspase-8抑制剂（z-IETD-FMK）来观察其对SG235-TRAIL感染白血病细胞株后诱导凋亡水平的影响;以各型腺病毒作用Hela细胞,通过结晶紫染色法和western blot法检测Caspase家族蛋白来明确SG235和SG235-TRAIL是否具有杀伤实体瘤细胞株的能力;收集临床确诊白血病患者骨髓液,检测原代白血病细胞的CD46表达情况;通过CFU-L和粒细胞-巨噬细胞集落（giranulocyte-macrophage colony forming unit,GM-CFU）形成能力实验来证实各型腺病毒是否具有选择性杀伤白血病细胞的特性;通过酶标记免疫吸附测定（enzyme-labeled immunosorbent assay,ELISA）法来检测各型腺病毒感染细胞后上清液TRAIL水平;通过观察各型腺病毒对Kasumi-1细胞荷瘤小鼠瘤体生长的影响以及TUNEL染色法来研究各型腺病毒在体内杀伤白血病细胞的作用。结果:（1）收集不同类型白血病患者原代白血病细胞122例,CD46总体阳性率为78.7%。表明以CD46作为受体的腺病毒载体SG235具备了感染白血病细胞的前提条件;（2）SG235体外实验中能够有效感染白血病、淋巴瘤和MM细胞株,并呈时间依赖性和剂量依赖性;（3）SG235本身能够诱导白血病细胞株发生凋亡,激活Caspase-9、Caspase-3和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly-（adenosinediphosphate -ribose）polymerase,PARP）,并具有剂量依赖性;（4）SG235-TRAIL和SG235都对白血病细胞株具有明显细胞毒作用,并具有剂量依赖性,而SG235-TRAIL较SG235细胞毒作用更显著;（5）SG235-TRAIL能够诱导白血病细胞株发生凋亡,且诱导凋亡效应较SG235更强;（6）SG235-TRAIL感染白血病细胞株中Caspase-8及其作用底物Bcl-2同源结构域3结构域凋亡诱导蛋白（Bcl-2homology 3 interacting domain death agonist,BID）激活,Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated X protein,BAX）上调,线粒体膜电位下降,而Caspase-9和Caspase-3也可见激活;（7）SG235-TRAIL诱导白血病细胞株凋亡的效应可以被Caspase-3抑制剂与Caspase-8抑制剂部分抑制,其中Caspase-3抑制剂作用更为明显;（8）SG235与SG235-TRAIL感染后,Kasumi-1细胞Bcl-2与粒细胞白血病序列-1（myeloid cell leukemia sequence-1,MCL-1）表达下调,而Bcl-2相互作用细胞死亡介导因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death,BIM）、Bcl-2同源拮抗物（Bcl-2homologous antagonist/killer,BAK）和Bcl-2样蛋白（Bcl-2 like protein,Bcl-XL）的表达未见明显改变;（9）SG235与SG235-TRAIL对实体瘤细胞株也有杀伤效应;（10）SG235以及携带TRAIL表达框的SG235-TRAIL能够有效感染原代白血病细胞,诱导其发生凋亡,激活Caspase-8、Caspase-3及PARP,并有效杀伤原代白血病细胞,而SG235-TRAIL作用较SG235更显著;（11）SG235与SG235-TRAIL能够有效感染CFU-L,并选择性抻制CFU-L形成,而SG235-TRAIL几乎完全抑制CFU-L的形成,此外,SG235与SG235-TRAIL不抑制或轻度抑制正常GM-CFU形成;（12）SG235-TRAIL感染白血病细胞株后表达TRAIL的水平要明显高于作为载体对照的Ad5/35-TRAIL组,SG235未见明显TRAIL表达。此外,SG235-TRAIL表达TRAIL水平呈时间依赖性;（13）SG235能显著抑制Kasumi-1细胞荷瘤小鼠瘤体生长,而ZD55几乎不影响瘤体生长;（14）SG235-TRAIL较SG235更能显著地抑制Kasumi-1细胞荷瘤小鼠瘤体生长,而且小鼠瘤体内凋亡细胞比例更高,而作为载体对照的Ad5/35-TRAIL没有表现出抗肿瘤效应。第二部分:溶癌腺病毒SG235-TRAIL协同高三尖杉酯碱杀伤白血病细胞的研究目的:根据化疗、基因治疗和病毒治疗三种手段相结合杀伤白血病细胞这一新思路,以SG235-TRAIL与HHT联合作用白血病细胞,并通过体外实验证实细胞毒作用并分析两者的协同效应,并进一步探讨其作用机制以及对正常细胞的杀伤效应,以期为临床白血病治疗提供新的方法和策略。方法:通过MTT法和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）法检测SG235-TRAIL与HHT对白血病细胞株的细胞毒作用,并通过Chou-Talalay联合指数法进行分析;通过PS转位法检测SG235-TRAIL与HHT诱导白血病细胞株凋亡;采用western blot法来检测SG235-TRAIL与HHT作用白血病细胞株后E1A、TRAIL、Caspase家族蛋白和Bcl-2家族蛋白的改变;通过MTT法检测SG235-TRAIL联合HHT对正常骨髓细胞的杀伤效应;体外培养和鉴定间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,并通过结晶紫染色法检测HHT和SG235-TRAIL对MSCs的细胞毒作用。结果:（1）SG235-TRAIL与HHT在体外联用杀伤白血病细胞株,表现出不同程度的协同效应;（2）SG235-TRAIL与HHT能协同诱导白血病细胞株凋亡;（3）SG235-TRAIL对白血病细胞株的感染能力及其复制水平没有因为HHT的联用而发生改变;（4）SG235-TRAIL与HHT联用作用Kasumi-1细胞,其TRAIL蛋白表达水平高于SG235-TRAIL单用;（5）SG235-TRAIL以激活Caspase-8为主,HHT以激活Caspase-9为主。而SG235-TRAIL与HHT联用能较大程度激活Caspase-8及其作用底物BID、Caspase-9、Caspase-3和PARP,同时下调Bcl-2和Mcl-1的表达;（6）SG235-TRAIL与HHT联用,白血病细胞株Bcl-2与Mcl-1表达下调;（7）SG235-TRAIL联合HHT对正常骨髓细胞的杀伤效应较小,具有靶向性。第三部分:溶癌腺病毒SG511-BECN抗白血病细胞的体内外研究目的:构建新型溶癌腺病毒SG511-BECN,其具有5型和11型嵌合纤毛并且E1B-55kDa缺失,同时携带BECN表达框,通过体内外实验证实SG511-BECN通过诱导白血病细胞自噬性死亡而发挥抗白血病细胞效应。从而为白血病靶向治疗提供基因治疗和病毒治疗相结合的手段。方法:构建新型溶癌腺病毒SG511、SG511-EGFP以及及SG511-BECN,通过荧光倒置显微镜、流式细胞术和western blot法检测beclin-1的手段,来研究SG511对白血病细胞株、淋巴瘤细胞株、MM细胞株、原代白血病细胞和CFU-L的感染能力及其复制活性;通过结晶紫染色法检测SG511-BECN对实体瘤细胞株的细胞毒作用,通过MTT法检测SG511-BECN对恶性血液病细胞株的细胞毒作用;通过吖啶橙染色法、透射电镜和微管相关蛋白1轻链3（light chain 3,LC3）-GFP-K562细胞荧光改变检测SG511-BECN诱导白血病细胞株自噬,并进一步通过western blot法检测SG511-BECN感染K562细胞后LC3和p62表达改变;通过观察各型腺病毒对K562细胞荷瘤小鼠瘤体生长的影响来研究各型腺病毒在体内杀伤白血病细胞的作用。结果:（1）SG511体外实验中能够有效感染白血病、淋巴瘤和MM细胞株,并呈剂量依赖性和细胞特异性;（2）SG511体外实验中能够有效感染CFU-L;（3）SG511-BECN能有效感染K562细胞,并表达beclin-1蛋白;（4）SG511-BECN和SG511在体外都对实体瘤细胞株、恶性血液病细胞株具有明显细胞毒作用,而SG511-BECN较SG511细胞毒作用更显著;（5）SG511-BECN在体外能够诱导白血病细胞株发生自噬,并伴随LC3-Ⅱ的表达和p62的降解;（6）SG511-BECN和SG511显著地抑制K562细胞荷瘤小鼠瘤体生长,而SG511-BECN较SG511细胞毒作用更显著。结论:SG235和SG511作为两种新型的具有嵌合纤毛的溶癌腺病毒,能有效感染白血病细胞株和原代白血病细胞,而携带了效应基因的SG235-TRAIL,不仅能发挥溶癌腺病毒的效应,还能诱导白血病细胞发生凋亡;同样,携带了效应基因的SG511-BECN,不仅能发挥溶癌腺病毒的效应,还能诱导白血病细胞发生自噬性死亡。此外,SG235-TRAIL联合HHT能够发挥协同抗白血病效应。
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