论文摘要
目的:目前关于Pin1在肿瘤细胞中的作用的研究主要是发现它与肿瘤细胞的分化和增殖有关,表现为在肿瘤细胞中过表达,在正常组织中表达低,去除它则肿瘤细胞增殖减低,凋亡增加,对于多种与肿瘤增殖和凋亡有关的信号通路关键因子有调节作用,如cyclinD1,p53等。众所周知,紫杉类抗肿瘤药物通过促进微管蛋白聚集并抑制解聚,从而阻止细胞周期于G2/M期,促进细胞凋亡,机制可能与使bcl-2基因表达下调,Bax基因表达上调有关。由目前研究的结果,Pin1基因也是一个与肿瘤细胞分化凋亡有关的基因,那么这二者之间有无关系,这正是我们所要关注的,实验从蛋白水平探索紫杉类药物是否会引起Pin1表达的变化及其可能机制。方法:1.紫杉醇对A549细胞中Pin1蛋白表达的影响培养A549细胞,先验证Pin1蛋白在其中呈现高表达。然后在培养的细胞中加入一定浓度的紫杉醇,先观察细胞的凋亡,然后在不同的时间点0h,24h,48h,72h,分别提取细胞总蛋白,设空白对照组,然后进行免疫印迹试验,评价Pin1蛋白的表达是否有变化。因为已有的研究证实单纯抑制Pin1的表达就可以导致肿瘤细胞增殖下降,凋亡增加,由此可以间接推断出该凋亡机制的存在。2.紫杉醇对E2F1表达的影响重新培养A549细胞,设定一个时间点（以紫杉醇所引起Pin1蛋白表达变化较大时的时间为参考）,实验组在加入实验浓度的紫杉醇,经过该时间后提取蛋白,另设空白对照组,也提取蛋白,进行免疫印迹实验,以评估蛋白的表达是否受到影响。目前已知E2F1是Pin1的上游指标,从而对引起Pin1表达变化的机制有一部分的指示,并可作进一步的推断。结果:1.紫杉醇对A549细胞中Pin1蛋白表达的影响免疫组化研究显示Pin1蛋白在A549细胞中呈现高表达,MCF-7作为阳性对照,PBS代替Pin1一抗作为阴性对照。紫杉醇作用后A549细胞凋亡明显增多（p<0.05）,其中在24小时的降低最为明显,48小时仍然存在,考虑24小时的凋亡主要不与Pin1相关。免疫印迹试验显示,Pin1蛋白的表达在给予紫杉醇后48小时开始降低,持续到72小时仍可见到抑制效应,考虑紫杉醇可引起Pin1蛋白表达下降,这是紫杉醇引起A549细胞凋亡的另一种机制。2.紫杉醇对E2F1表达的影响在给予和不给于1nmol/L的紫杉醇作用48小时后,试验组E2F1蛋白的表达明显较对照组减低（p<0.05）,显示紫杉醇对E2F1蛋白的表达产生了抑制,并通过这种作用影响了Pin1的表达,由此又促成了凋亡。结论:1. Pin1蛋白在人肺腺癌A549细胞中呈现高表达,经紫杉醇作用后,A549细胞凋亡明显增多,Pin1蛋白的表达也随着时间的延长而出现下降,提示Pin1参与了紫杉醇所致的A549细胞凋亡。2.在紫杉醇作用后48小时,E2F1蛋白的表达出现明显下降,可以得知紫杉醇通过抑制E2F1的表达从而影响Pin1的表达,由此也会增加细胞的凋亡,这是另一条凋亡机制。