奶酪关键致病菌安全的生物控制研究

论文摘要

根据联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）制定的国际上通用的奶酪定义,奶酪是以牛乳、奶油、部分脱脂乳、酪乳或这些产品的混合物为原料,经凝乳并分离乳清而制得的新鲜或发酵成熟的乳制品。奶酪含有丰富的蛋白质、钙、脂肪、氨基酸、磷和维生素等营养成分,其营养价值高,深受世界人民的喜爱。奶酪在西方国家消费量是相当大的。近年来中国的奶酪事业也蒸蒸日上。但是随着几起与奶酪消费有关的大的李斯特菌病的爆发和人们对健康绿色食品的推崇,奶酪的安全卫生问题越来越受到大家的关注。由于Listeria monocytogenes是奶酪中的关键致病菌之一,所以利用一种安全无毒的方式控制奶酪中的Listeria monocytogenes成为解决奶酪安全卫生问题的焦点。众所周知,乳酸菌代谢产生很多物质如有机酸、过氧化氢、双乙酰和细菌素等都可以通过改变食品的内在特性来抑制腐败菌的生长,人们很久以前就开始认识和使用这些终产物,但直到最近几十年才开始真正研究它们。细菌素是某些细菌产生的抑菌肽或蛋白,这些物质可以杀灭和抑制与之相同或相似生境的其他微生物。虽然许多细菌都能产生细菌素,但乳酸菌产生的细菌素更适合在食品工业中应用。现在只有几种商品化的细菌素面市,如nisin和pediocinPA-1,nisin作为食品添加剂可以非常有效的抑制许多食品中的腐败菌,并延长其货价期。但现在有些Listeria monocytogenes的变种已经对nisin产生了抗性,所以我们要继续大力开发抗李斯特菌的细菌素。本研究从51株肠球菌中筛选出两株具有抑菌活性的肠球菌菌株:粪肠球菌KLDS6.0610和粪肠球菌KLDS6.0611。在排除有机酸和过氧化氢的干扰后,两株菌的无细胞发酵上清液对指示菌还有强烈的抑制作用。经蛋白酶K处理后,抑菌活性丧失,证明无细胞发酵上清液中含有蛋白性质的抑菌物质,即细菌素。两株肠球菌经16S rDNA序列同源性分析鉴定均为粪肠球菌。通过观察血琼脂平板上两株菌单菌落周围的溶血圈,判定两株菌都没有溶血作用。利用药敏片法测验了两株菌对万古霉素的抗性,证明两株菌对抗生素没有抗性。初步证明两株菌都是安全的。两株肠球菌在MRS中37℃培养都能产生细菌素,其中KLDS6.0610在接种20h时细菌素产量达到最高,KLDS6.0611在接种16h时细菌素产量达到最高。两种细菌素都对热不敏感,121℃加热30min仍有活性。细菌素在pH2.5pH6.5的范围内有抑菌活性,pH值大于6.5时活性消失。KLDS6.0610产的细菌素能被胃蛋白酶、蛋白酶K和a-糜蛋白酶部分失活,不能被a-淀粉酶失活。KLDS6.0611产的细菌素能被胃蛋白酶、胰蛋白酶、a-糜蛋白酶、a-淀粉酶和蛋白酶K部分失活。两种细菌素都对木瓜蛋白酶不敏感。KLDS6.0610产的细菌素对指示菌的作用方式是抑菌,KLDS6.0611产的细菌素对指示菌的作用方式是杀菌。两株肠球菌都不吸附自己产的细菌素。两株肠球菌都能在脱脂乳中产生细菌素,但是细菌素的产量没有MRS中高。对细菌素进行了初步纯化,采用硫酸铵沉淀法,重新溶于原体积1/40的MilliQ水中。用Tricine-SDS-PAGE测定细菌素的分子量,其中KLDS6.0610产生的细菌素的分子量约为, KLDS6.0611产生的细菌素的分子量约为测定了储存期内各奶酪样品的水分含量,得知各奶酪的水分含量都在67%左右,符合GB/T 21375-2008对软奶酪的要求。储存期内各奶酪的蛋白含量都在25.5%28%之间,没有明显变化。4℃储存5天内,添加细菌素和细菌素产生菌的奶酪样品与对照组比,L. monocytogenes数目均有所减少,添加细菌素的奶酪中L. monocytogenes的数目比添加细菌素产生菌的奶酪中L. monocytogenes的数目少且添加两种细菌素的奶酪比添加一种细菌素的奶酪中的L. monocytogenes少。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 立题背景
• 1.2 研究的目的及意义
• 1.3 文献综述
• 1.3.1 奶酪概述
• 1.3.2 Listeria monocytogenes 概述
• 1.3.3 细菌素及其应用
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 指示菌菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 奶酪原料
• 2.1.5 化学试剂及来源
• 2.2 仪器与设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 细菌素产生菌的筛选鉴定
• 2.3.2 肠球菌的安全性评估
• 2.3.3 细菌素的部分生物学特性
• 2.3.4 细菌素的初步纯化及分子量估测
• 2.3.5 用细菌素控制奶酪中的L. monocytogenes
• 2.3.6 数据的分析与处理
• 3 结果与分析
• 3.1 细菌素产生菌的筛选鉴定结果
• 3.1.1 初筛结果
• 3.1.2 复筛结果
• 3.1.3 菌株产细菌素的鉴定
• 3.1.4 产细菌素肠球菌的鉴定
• 3.1.5 小结
• 3.2 肠球菌的安全性评估结果
• 3.2.1 溶血作用结果
• 3.2.2 万古霉素抗性结果
• 3.2.3 小结
• 3.3 细菌素的部分生物学特性结果
• 3.3.1 细菌素的产生
• 3.3.2 细菌素对温度的敏感性结果
• 3.3.3 细菌素对pH 值的敏感性
• 3.3.4 细菌素对酶的敏感性结果
• 3.3.5 细菌素对指示菌的作用方式
• 3.3.6 细菌素产生菌对细菌素的吸附作用结果
• 3.3.7 脱脂乳培养基中细菌素的产生结果
• 3.3.8 小结
• 3.4 细菌素的初步纯化及分子量估测结果
• 3.4.1 硫酸铵沉淀细菌素结果
• 3.4.2 细菌素分子量的估测
• 3.4.3 小结
• 3.5 细菌素对奶酪中L. monocytogenes 的控制结果
• 3.5.1 奶酪的理化成分
• 3.5.2 奶酪中的微生物控制结果
• 3.5.3 小结
• 4 讨论
• 4.1 抑菌活性测定方法
• 4.2 细菌素的鉴定
• 4.3 肠球菌的安全性评估
• 4.4 细菌素的生物学特性
• 4.4.1 细菌素的产生
• 4.4.2 细菌素对温度的敏感性
• 4.4.3 细菌素对pH 值的敏感性
• 4.4.4 细菌素对酶的敏感性
• 4.4.5 细菌素对指示菌的作用方式
• 4.4.6 细菌素产生菌对细菌素的吸附
• 4.4.7 脱脂乳培养基中细菌素的产生
• 4.5 细菌素的初步纯化和分子量估测
• 4.5.1 硫酸铵沉淀蛋白质
• 4.5.2 SDS-PAGE
• 4.6 细菌素在乳制品中的应用
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文