革皮氏海参皂苷抗肿瘤活性及其作用机制的研究

论文摘要

海参皂苷是海参体壁中重要的活性成分之一,具有多种生物活性。不同种类的海参因生活环境的不同,其体内皂苷含量和结构差别较大。革皮氏海参（Pearsonothuria graeffei）归属楯手目（Aspidochirotida）海参科（Holothuriidae）皮氏海参属（Pearsonothuria）,是一种皂苷含量高的低值海参。开展革皮氏海参皂苷活性的研究,对于革皮氏海参的高值化加工利用和深度开发有重要的意义。本论文研究了革皮氏海参皂苷抗肿瘤活性及其作用机制,并对其构效关系进行了初步探讨。主要研究结果如下:采用S180建立移植性肿瘤小鼠模型,研究了革皮氏海参总皂苷的体内抗肿瘤作用和对氧化水平的调节作用。结果表明,革皮氏海参总皂苷能显著抑制S180移植瘤的生长;显著提高荷瘤小鼠血清和肝脏中还原型谷胱甘肽（Reduced glutathione,GSH）的含量（P<0.05）,谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione-Peroxidase,GSH-PX）活力（P<0.05）和谷胱甘肽转移酶（Glutathione Transferase,GST）的酶活力（P<0.05）。提示革皮氏海参皂苷能全面提高机体的抗氧化水平,抑制肿瘤的生长。利用从革皮氏海参中分离得到的三萜皂苷holothurin A1（HA）和24-dehydroechinoside A（DA）为研究对象,比较研究了HA和DA体外抗肿瘤活性及其作用机制。采用MTT方法,研究了HA和DA对HepG2、B16、Caco-2、Hela、P388、S180等多种肿瘤细胞生长的影响。结果表明,HA和DA均具抑制肿瘤细胞生长的作用。其中,DA活性高于HA,HA和DA对HepG2细胞的活性最强;在上述研究的基础上,以HepG2细胞为研究对象,对HA和DA的抗肿瘤作用机制进行研究。采用LDH方法,研究了HA和DA对Hep G2细胞培养上清中LDH含量的影响,利用倒置显微镜和荧光显微镜观察肿瘤细胞一般形态变化和细胞核凋亡变化,利用流式细胞仪检测HA和DA对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的影响。结果表明,HA和DA可以将肿瘤细胞阻断在G0/G1期,诱导肿瘤细胞发生凋亡。其中,DA的活性高于HA。采用划痕法、细胞粘附实验、Transwell小室法和免疫细胞化学染色法,比较研究了HA和DA抗肿瘤细胞转移活性及其作用机制。结果表明,HA和DA均可显著抑制肿瘤细胞迁移（P<0.05）,降低肿瘤细胞与基质（P<0.01）、血管内皮细胞（P<0.01）间的粘附能力,降低肿瘤细胞侵袭能力（P<0.01）,下调基质金属蛋白酶-9（MMP-9）并提高基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1的表达。提示HA和DA能通过降低MMP-9的表达,降低肿瘤细胞的运动能力、粘附能力、侵袭能力,抑制肿瘤细胞的转移。其中,DA的活性高于HA。采用MTT法、细胞核凋亡染色、体外小管形成实验、鸡胚尿囊膜法和Western-blotting法研究了HA和DA抗肿瘤血管新生的活性及其机制。结果表明,HA和DA均具有抑制血管内皮细胞增殖的活性（48h的IC50值分别为4.80μmol/L,3.82μmol/L）,能促进血管内皮细胞的凋亡,在体外抑制内皮细胞小管的形成,下调肿瘤细胞血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）的表达。提示HA和DA均能通过诱导内皮细胞凋亡,降低肿瘤细胞促血管生长因子的表达,抑制肿瘤血管新生。其中,DA的活性高于HA。HA和DA在苷元结构上有差异,其中HA在苷元的侧链的C-22有羟基取代;DA有一个双键,位于侧链的24（25）位。提示在苷元侧链上C-22的羟基取代会降低皂苷抑制肿瘤生长和转移活性,侧链上24（25）位的双键可以提高皂苷抑制肿瘤生长和转移活性。本论文首次系统研究了革皮氏海参皂苷的抗肿瘤活性,初步阐明HA和DA抑制肿瘤生长和转移的机制,探讨了其构效关系,为革皮氏海参皂苷的进一步开发和综合利用科学提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 海参皂苷的研究进展
• 1.1 革皮氏海参概况
• 1.2 海参皂苷的结构和抗肿瘤活性
• 1.3 皂苷类物质抗肿瘤作用的研究进展
• 2 肿瘤转移（METASTASIS）和血管新生（ANGIOGENESIS）
• 2.1 肿瘤侵袭（Invasion）
• 2.2 肿瘤血管新生
• 3 肿瘤转移和肿瘤血管新生的相关因子
• 3.1 核转录因子（Nuclear Factor - kappa B，NF-кB）
• 3.2 基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMPs）家族
• 3.3 血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）.
• 4 抗肿瘤转移药物研究现状
• 5 立题依据、研究的目的和意义
• 第一章 革皮氏海参总皂苷体内抗肿瘤作用的研究
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 统计学分析
• 2 实验结果
• 2.1 对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
• 2.2 对荷瘤小鼠血清GSH 含量、GSH-PX 酶和GST 酶活力的影响
• 2.3 对荷瘤小鼠肝脏GSH 含量、GSH-PX 酶和GST 酶活力的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 革皮氏海参皂苷单体体外抗肿瘤生长的研究
• 第一节 革皮氏海参皂苷单体抗肿瘤活性筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.5 统计学分析
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 革皮氏海参皂苷单体对肿瘤细胞凋亡的影响
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.5 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 对HepG2 细胞培养上清中LDH 释放量的影响
• 2.2 对HepG2 细胞一般形态的影响
• 2.3 对HepG2 细胞凋亡形态的影响（AO/EB 染色）
• 2.4 对HepG2 细胞周期的影响（PI 单染法）
• 2.5 对HepG2 细胞的凋亡的影响（Annexin V-FITC 双染法）
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 革皮氏海参皂苷单体抗肿瘤转移作用的研究
• 第一节 革皮氏海参皂苷单体抗肿瘤转移作用的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.5 统计学分析
• 2 实验结果
• 2.1 对HepG2 细胞迁移能力的影响
• 2.2 对HepG2 细胞同基质间粘附能力的影响
• 2.3 对HepG2 和ECV304 细胞间粘附的影响
• 2.4 对HepG2 细胞侵袭能力的影响
• 2.5 对HepG2 细胞MMP-9 蛋白表达的影响
• 2.6 对HepG2 细胞TIMP-1 蛋白表达的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二节 革皮氏海参皂苷单体抗肿瘤血管新生的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 实验方法
• 1.5 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 对ECV304 细胞增殖活性的影响
• 2.2 对ECV304 细胞一般形态学观察
• 2.3 对ECV304 细胞凋亡的形态学观察
• 2.4 对ECV304 细胞体外小管形成能力的影响
• 2.5 对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的影响
• 2.6 对HepG2 细胞VEGF 蛋白表达的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 本论文的特色及创新之处
• 参考文献
• 致谢
• 发表的学术论文