超长链多不饱和脂肪酸合成相关酶基因的克隆与鉴定及其在作物中的异源合成

论文摘要

超长链多不饱和脂肪酸（very long chain polyunsaturated fatty acids,VLCPUFAs）,比如花生四烯酸（AA,20:4Δ5,8,11,14）、二十碳五烯酸（EPA,20:5Δ5,8,11,14,17）和二十二碳六烯酸（DHA,22:6Δ4,7,10,13,16,19）对人体营养和健康具有重要的意义。其中,EPA、DHA是鱼油的主要有效成分。目前,该类脂肪酸的主要来源是深海鱼油。但由于海洋鱼类捕捞量的下降以及环境污染等原因导致鱼油的产量和质量无法满足人类的需求。因而,寻找更为经济、稳定、安全、可持续的EPA和DHA来源成为当务之急。利用基因工程的方法,将EPA/DHA合成途径重组到高等植物中,从而在高等植物,特别是油料作物中生产鱼油,将是一条鱼油的新来源。本文分别在富含EPA或DHA的球等鞭金藻、马铃薯致病疫霉和强壮前沟藻中,克隆并鉴定了EPA/DHA合成途径中的去饱和酶基因四个;开发了一种新的多基因表达载体构建方法;并利用该方法,成功将EPA合成途径中的五个关键酶基因串联在一个表达载体中,并对高等植物进行了遗传转化。PCR证明转基因植株含有相应基因,并检测到了AA和EPA在这些植株中的生成。主要结果如下:（1）球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因的克隆及功能鉴定我们利用RACE的方法在球等鞭金藻cDNA文库中同源克隆到一个大小为1329bp的cDNA片段,编码442个氨基酸的多肽,分子量约49.9kDa。生物信息学分析表明,其编码产物具备去饱和酶所具有的N端细胞色素b5结构域,以及与电子传递有关的三个富含组氨酸的结构域,与来源于另一海洋微藻Pavlova salina的Δ5去饱和酶同源性最高,达56%,故将该基因命名为IgD5。酿酒酵母功能鉴定实验表明,其编码的蛋白质能够将二高-γ-亚麻酸(DGLA,20:3Δ8,11,14)转化成花生四烯酸(AA,20:4Δ5,8,11,14),具有Δ5去饱和酶活性,并且具有底物专一性。（2）马铃薯致病疫霉Δ6、Δ5和Δ12去饱和酶基因的克隆及功能鉴定利用生物信息学的方法,从近来完成测序的马铃薯致病疫霉的基因组数据库中搜索到三个可能分别编码Δ6去饱和酶（PinD6）、Δ5去饱和酶（PinD5）以及Δ12去饱和酶基因（PinD12）的序列,利用RT-PCR的方法,在马铃薯致病疫霉cDNA中对它们进行扩增,得到分别长1197、1371和1551bp的开放阅读框,分别编码398、456和516个氨基酸。这三个去饱和酶都具有一般去饱和酶所具备的三个组氨酸框结构域,其中,PinD6和PinD5还具备front-end去饱和酶细胞色素b5结构域。酿酒酵母功能鉴定实验表明:PinD6编码的蛋白质能够将亚油酸(LA,18:2Δ9,12)和亚麻酸(ALA,18:3Δ9,12,15)分别转化成γ-亚麻酸(GLA,18:3Δ6,9,12)和十八碳四烯酸(SDA,18:4Δ6,9,12,15);PinD5编码的蛋白质能够将二高-γ-亚麻酸(DGLA,20:3Δ8,11,14)转化成花生四烯酸（AA,20:4Δ5,8,11,14）;PinD12编码的蛋白质能够将脂肪酸16:1Δ9和油酸（OA,18:1Δ9）分别转化成16:2Δ9,12和亚油酸(LA,18:2Δ9,12),分别具有Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶以及Δ12去饱和酶活性。并且这三个酶都具有很好的底物专一性。结合以前已经克隆到的Δ17去饱和酶和Δ6链延长酶以及马铃薯致病疫霉脂肪酸的分布,我们推断马铃薯致病疫霉中AA和EPA可能主要是通过ω6/Δ6途径来实现的。（3）强壮前沟藻中DHA合成相关基因的克隆我们对富含DHA（12%）的强壮前沟藻的转录组进行了测序,分析并获得了可能的去饱和酶基因EST序列4个和链延长酶基因的EST序列5个,并进一步利用RACE的方法,获得了全部序列的3′端,以及编号为AcD20的一个特异的超长链多不饱和脂肪酸去饱和酶的全长序列,其功能正在检测中。（4）多基因表达载体构建方法的开发我们发明了一个新的多基因表达载体构建的方法。该方法需要一个辅助载体,辅助载体具有-XbaI-MCS-AvrⅡ-XbaI-的结构,其中,XbaI和AvrⅡ是同尾酶。目的片段分别克隆到辅助载体的多克隆位点MCS上。方法原理如下:将目的片段1、2、3…分别亚克隆到辅助载体中,得到含有（-XbaI-片段1-AvrⅡ-XbaI-）、（-XbaI-片段2-AvrⅡ-XbaI-）、（-XbaI-片段3-AvrⅡ-XbaI-）…等一系列质粒。由于XbaI和AvrⅡ是同尾酶,二者酶切后可获得相同的粘性末端。将片段2在质粒（-XbaI-片段2-AvrⅡ-XbaI-）中用XbaI切下,连接到经AvrⅡ线性化的质粒（-XbaI-片段1-AvrⅡ-XbaI-）,鉴定方向后,获得带有目的片段1和2的质粒（-XbaI-片段1-（?）–片段2-AvrⅡ-（?）-XbaI-）,而新形成的（?）和（?）不能够再被XbaI或AvrⅡ切开。同时随着片段2的加入,又添加了一个新的AvrⅡ酶切位点,因而可以相同方式接受目的片段3的插入。我们构建了四个辅助载体pAUX1、pAUX2、pAUX1GW和pAUX2GW,并成功的将GUS、GFP和BAR基因的表达盒及两个TM2序列串联在一起,并在拟南芥中检测到了三个基因的表达,首先验证了此方法的可行性。（5）EPA在作物中的异源合成我们构建了含有四个脂肪酸去饱和酶基因和一个链延长酶基因的用于生产EPA的植物表达载体pCamBAR-5EC,用农杆菌侵染的方法对玉米、棉花和花生等农作物进行了遗传转化。初步获得了PCR检测为阳性的转基因玉米和棉花植株,并在玉米叶片中检测到了AA和EPA的存在。目前,棉花中的AA和EPA等脂肪酸情况正在检测中。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 VLCPUFAs 的研究进展
• 1.1.1 VLCPUFAs 的命名及分类
• 1.1.2 VLCPUFAs 的生物学功能
• 1.1.2.1 VLCPUFAs 对人体具有重要生理功能
• 1.1.2.2 VLCPUFAs 参与植物防御信号途径
• 1.1.2.3 VLCPUFAs 与环境保护
• 1.1.3 VLCPUFAs 的生物合成途径
• 1.1.4 VLCPUFAs 合成相关基因
• 1.1.5 球等鞭金藻中VLCPUFAs 合成相关基因的克隆
• 1.1.6 马铃薯致病疫霉中VLCPUFAs 合成相关基因的克隆
• 1.1.7 强壮前沟藻中VLCPUFAs 合成相关基因的克隆
• 1.1.8 VLCPUFAs 的来源及面临的挑战
• 1.1.9 VLCPUFAs 在转基因植物中的生产
• 1.1.9.1 VLCPUFAs 在高等植物中生产的可行性
• 1.1.9.2 VLCPUFAs 在农作物种子中的生产及存在的问题
• 1.2 多基因聚合技术研究进展
• 1.2.1 杂交法
• 1.2.2 分次转化法
• 1.2.3 共转化法
• 1.2.4 一次转化法
• 1.2.4.1 多聚蛋白酶解法
• 1.2.4.2 独立基因表达盒法
• 1.2.5 独立基因表达盒法研究进展
• 1.2.5.1 借助稀有归巢内切酶的方法
• 1.2.5.2 利用Cre/loxP 重组系统的方法
• 1.2.5.3 基于Gateway 技术的方法
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料及生长条件
• 2.1.2 马铃薯致病疫霉及生长条件
• 2.1.3 酿酒酵母YPH500 及生长条件
• 2.1.4 球等鞭金藻及生长条件
• 2.1.5 菌株及质粒
• 2.1.6 酶及生化试剂
• 2.1.7 本论文所用引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组DNA 提取（SDS 法）
• 2.2.2 总RNA 的提取（TriZol 法）
• 2.2.3 RNA 甲醛变性胶电泳检测
• 2.2.4 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.5 PCR 扩增
• 2.2.6 连接反应
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.7.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7.2 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.8 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.9 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.10 去磷酸化反应
• 2.2.11 DNA 片段的回收
• 2.2.12 表达载体的构建
• 2.2.13 酿酒酵母的转化
• 2.2.14 酿酒酵母的诱导表达及菌体收集
• 2.2.15 根癌农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.15.1 根癌农杆菌冻融法感受态细胞的制备
• 2.2.15.2 根癌农杆菌电转化感受态制备
• 2.2.15.3 冻融法转化农杆菌
• 2.2.15.4 电击法转化农杆菌
• 2.2.16 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.16.1 种子处理
• 2.2.16.2 移栽拟南芥
• 2.2.16.3 拟南芥转化
• 2.2.17 转基因植株分析
• 2.2.18 转基因拟南芥植株的GUS 活性组织化学染色
• 2.2.19 脂肪酸的提取及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 超长链多不饱和脂肪酸合成相关基因的克隆与功能鉴定
• 3.1.1 球等鞭金藻中Δ5 去饱和酶基因的克隆与功能鉴定
• 3.1.1.1 球等鞭金藻脂肪酸成分分析
• 3.1.1.2 IgD5 全长cDNA 序列的获得
• 3.1.1.3 IgD5 与其它去饱和酶的同源性分析
• 3.1.1.4 IgD5 基因酵母表达载体的构建
• 3.1.1.5 IgD5 去饱和酶在酿酒酵母中活性测定
• 3.1.2 马铃薯致病疫霉中去饱和酶基因PinD12、PinD6 和PinD5 的克隆及功能鉴定
• 3.1.2.1 生物信息学的方法获得三个新的脂肪酸去饱和酶基因
• 3.1.2.2 马铃薯致病疫霉的脂肪酸成分分析
• 3.1.2.3 三个去饱和酶基因酵母表达载体的构建
• 3.1.2.4 三个去饱和酶基因在酿酒酵母中的功能鉴定
• 3.1.3 强壮前沟藻中DHA 合成相关基因的克隆与功能鉴定
• 3.1.3.1 强壮前沟藻脂肪酸成分分析
• 3.1.3.2 DHA 合成相关基因的EST 序列的筛选
• 3.1.3.3 DHA 合成相关基因3′端获得
• 3.1.3.4 编号为AcD20 的去饱和酶的全长基因的获得
• 3.1.3.5 酵母表达载体的构建及功能鉴定
• 3.2 多基因表达载体构建方法的开发设计
• 3.2.1 方法原理
• 3.2.2 辅助载体的构建
• 3.2.3 多基因表达载体构建方法的验证
• 3.2.3.1 TM2 片段及GUS、GFP、BAR 基因的获得
• 3.2.3.2 各目的片段亚克隆到辅助载体
• 3.2.3.3 过渡载体pAUX-TM2GUSGFPBARTM2 的组装及酶切检测
• 3.2.3.4 植物表达载体pCambia2300-TM23ECTM2 的构建
• 3.2.3.5 GUS、GFP 和BAR 基因在拟南芥中的分子鉴定及表达检测
• 3.3 EPA 在作物中的异源合成
• 3.3.1 EPA 合成相关酶基因的获得
• 3.3.1.1 高山被孢霉Δ5 去饱和酶基因的获得
• 3.3.1.2 拟南芥Δ15 去饱和酶基因的获得
• 3.3.1.3 马铃薯致病疫霉Δ17 去饱和酶基因的获得
• 3.3.1.4 眼虫藻Δ8 去饱和酶基因的获得
• 3.3.1.5 球等鞭金藻Δ9 链延长酶基因的获得
• 3.3.2 亚克隆各个基因到辅助载体pAUX2
• 3.3.2.1 球等鞭金藻Δ9 链延长酶基因的亚克隆
• 3.3.2.2 眼虫藻Δ8 去饱和酶基因的亚克隆
• 3.3.2.3 高山被孢霉Δ5 去饱和酶基因的亚克隆
• 3.3.2.4 拟南芥Δ15 去饱和酶基因的亚克隆
• 3.3.2.5 马铃薯致病疫霉Δ17 去饱和酶基因的亚克隆
• 3.3.3 五个基因表达盒的串联
• 3.3.4 植物表达载体pCamBAR-5EC 的获得
• 3.3.5 植物表达载体pCamBAR-5EC 的应用
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况