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猪PNAS-4基因的结构与功能研究及α1，3-GT基因敲除载体的构建

2020-11-22阅读(351)

猪PNAS-4基因的结构与功能研究及α1，3-GT基因敲除载体的构建

论文摘要

贯穿于机体整个生命周期的细胞凋亡对机体的发育、存活及维持正常生理功能都有着重要意义，尤其是在个体发育、细胞分化、组织器官形成过程中都发挥着重要作用。而骨骼肌在不同的生长发育过程中涉及大批基因的差异表达及网络调控，而这些差异表达的基因很可能在生长发育过程中调控着某些细胞的增殖与凋亡。根据该推理假设，本研究从构建的猪胎儿骨胳肌cDNA文库中挑选出一个在组织及不同发育时期都有差异表达的未知基因作为研究对象，并通过分子生物学、细胞生物学以及生物信息学等方法从核酸及蛋白质两个水平上进行了结构与功能研究，并取得了如下研究结果：1．猪的PNAS-4基因cDNA全长序列的获得根据已获得的该基因部分信息，采用电脑克隆策略结合RACE技术，获得了猪的PNAS-4基因的5’非翻译区序列，然后通过PCR方法填补了序列中一个82bp的Gap，从而得到该基因的cDNA全长4133bp，并提交GenBank数据库，GenBank收录号DQ435075；2．cDNA序列上的功能元件分析对猪的PNAS-4 cDNA序列进行分析，发现该基因的在5’UTR区有一内源性核糖体进入位点（IRES），而在3’UTR区除了有两个多（聚）腺苷酸加尾信号（AATAAA）外，还存在着两个功能域框Brd-Box和GY-Box，其中Brd-Box通过影响转录的稳定性和翻译的效率来介导转录后负调控；3．人的同源基因clorf121的启动子区域调控因子的分析利用人的同源基因clorf121的启动子区域进行网络调控分析时发现，有一个CpG岛附近有着较多的转录因子（Sp1、AP-1）的结合点，说明该基因具有较强的转录效率，另外还发现在启动子区域有较多的抑凋亡因子结合位点。根据其CpG岛的GC含量高及无TATA box的特征推测该基因是一个无处不表达的持家基因；4．推导的该编码的基因蛋白质特点由该基因CDS序列推导出猪的PNAS-4编码着是一个含有194个氨基酸残基，是一个既无信号肽又无跨膜结构的非分泌性蛋白质；并对其保守的功能域DUF862进行了三维结构的模拟，发现其有三个可能的蛋白质结合域以及三个裸露在外的氨基酸残基；同源比对后，发现该基因在哺乳动物之间同源性极高达96-98％，与家禽及非洲蟾蜍分别有着94％和74％的相似性，甚至拟南芥的该蛋白质与猪也有着45％的相似性；5．多态检测及连锁不平衡分析利用比较基因组学通过PCR方法获得猪的该基因第二内含子全长，并提交GenBank数据库，GenBank收录号DQ406743。通过PCR-RFLP及DHPLC技术对第二内含子及3’UTR区共计四个SNPs位点进行多态分析，发现这四个多态位点在不同品种中表现出等位基因频率的差异。这四个位点虽相隔20Kb，但却不同程度地相互处于连锁不平衡状态。通过性状关联分析，发现该基因不同基因型个体在内脂率、板油率、腿臀肉骨率、胴体直长、眼肌面积以及血红蛋白浓度等性状存在显著性差异（P＜0.05）；6．应用定量PCR进行时空表达谱分析通过real-time PCR方法研究了猪的PNAS-4基因在成年猪15个组织中的表达情况，发现该基因在所研究的组织中均有表达，但存在表达量的差异，其中，骨胳肌和淋巴组织中表达量最高，肾和大脑中表达量最低。另外还发现该基因在癌化的猪肾上皮细胞中的表达量要比正常肾组织要高。而在胚胎发育时期，该基因在骨胳肌中的表达呈现下调表达模式，但出生后呈现出上调表达模式。将该基因在胚胎时期的表达模式进行比较，发现该基因在中外猪种骨骼肌的发育过程中并不存在差异表达；7．该基因的原核表达按照常规的实验方法对该基因进行原核表达，并没有发现特异性条带，推测可能是由于大肠杆菌密码子的偏爱造成了该基因在原核生物中的表达障碍；8．亚细胞定位利用绿色荧光表达载体pEGFP-C1与该基因编码框进行融合表达，转染并染色后通过共聚焦显微镜进行观察，发现猪的PNAS-4基因的蛋白质CGI-146明显分布于高尔基体，说明该蛋白质存在于高尔基体内并发挥其生物学功能；9．通过真核表达载体pcDNA3.1进行超表达将该基因编码框插入到真核超表达载体peDNA3.1中，进行细胞转染后，利用倒置显微镜在普通视野下观察发现，随着转染后时间的延长，越来越多的细胞出现萎缩，浓缩等凋亡现象；通过细胞凋亡检测试剂盒染色后，在倒置荧光显微镜FITC和若丹明双重滤镜下观察到凋亡早期、中期及晚期细胞，从而初步确定了该基因具有促凋亡的特性。器官移植作为20世纪医学领域发展起来的新兴技术已经成为治疗器官功能衰竭终末期的首要治疗手段。全世界每年有数万名器官功能衰竭患者通过器官移植而获新生。然而供体器官的严重不足，使得许多病人在等待中死去，而物种间异种移植则成为了解决该医学问题的最好方法。进行猪-人异种器官移植，首先要解决的问题是克服超急性排斥反应（HAR）。它是由猪的血管内皮细胞表面α-Gal抗原与人体内的天然抗体结合，从而激活补体级联反应而发生的。经研究证实，该抗原是由一组具有Galα（1，3）Gal双糖末端的糖蛋白或糖脂组成的，它的形成依赖于α1，3-半乳糖基转移酶（α1，3-GT）的催化。因此利用生物工程技术敲除该基因将能在很大程度上有效地克服HAR。基因打靶是80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术。它是通过外源DNA与受体细胞基因组中的同源序列之间发生重组，从而定向改变细胞或生物个体遗传信息的实验手段。目前，该技术已先后在小鼠、绵羊、山羊、牛和猪的体细胞中获得成功。本研究利用现有的α1，3-GT基因序列信息，成功构建了正负双筛选基因打靶载体，期望在后续实验中通过体细胞基因打靶技术获得敲除α1，3-GT基因的高近交五指山猪品系，从而为我国的异种器官移植提供更为理想的实验动物。利用长距离PCR（LR-PCR）方法，从高近交系五指山猪的基因组中成功得到了5.4Kb、1.6Kb的扩增产物。其中5.4Kb的DNA片段包括了α1，3-GT完整的第8内含子；1.6Kb的DNA片段覆盖了大部分第9外显子。考虑到5.4Kb的DNA片段中存在限制性内切酶SalⅠ位点，于是通过PCR方法选取其中的5.1Kb DNA片段作为打靶载体的5’同源臂，并将1.6Kb的DNA片段作为3’同源臂，以neo为正选择标记基因，以HVS-tk为负选择标记基因，构建敲除猪α1，3-GT基因部分序列打靶载体PLS-pPNT，全长约15.2Kb，并经测序验证，从而为后续实验打下了良好基础。

论文目录

  • 第一部分 猪PNAS-4基因的结构与功能研究
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1 文献综述
  • 1.1 PNAS-4基因研究进展
  • 1.1.1 猪的PNAS-4基因研究现状
  • 1.1.2 其它物种PNAS-4基因的研究现状
  • 1.2 细胞凋亡
  • 1.2.1 细胞凋亡概述
  • 1.2.2 生物学意义
  • 1.2.3 细胞凋亡的形态学和生化特征
  • 1.2.4 研究历程
  • 1.2.5 细胞凋亡的过程
  • 1.2.6 细胞凋亡的检测方法
  • 1.3 高尔基体的研究进展
  • 1.3.1 高尔基体的形态结构
  • 1.3.2 生物学功能
  • 1.3.3 研究现状
  • 1.4 实时定量PCR
  • 1.4.1 原理
  • 1.4.2 检测技术
  • 1.5 蛋白质的亚细胞定位
  • 1.5.1 亚细胞定位在基因功能研究中的地位
  • 1.5.2 蛋白质亚细胞定位方法
  • 1.6 变性高效液相色谱
  • 1.6.1 DHPLC概念及原理
  • 1.6.2 主要应用领域
  • 2 研究目的与意义
  • 3 材料与方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 核酸样品
  • 3.1.2 菌株、质粒和细胞
  • 3.1.3 RNA提取及检测用缓冲液
  • 3.1.4 主要培养基
  • 3.1.5 原核表达结果检测所用缓冲液
  • 3.1.6 真核细胞转染试剂盒与染色液
  • 3.1.7 其它生化试剂
  • 3.1.8 主要仪器设备
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 本研究的整体思路
  • 3.2.2 总RNA的提取、检测和DNase-Ⅰ处理
  • 3.2.3 反转录、扩增检测
  • 3.2.4 PCR产物的纯化、克隆与测序
  • 3.2.5 cDNA全长的获得
  • 3.2.6 基因的单核苷酸多态检测
  • 3.2.7 时空表达谱分析
  • 3.2.8 细胞培养
  • 3.2.9 原核表达载体的构建与表达
  • 3.2.10 荧光表达载体的构建与转染
  • 3.2.11 超表达载体的构建与转染
  • 3.2.12 数据统计与分析
  • 4 结果与分析
  • 4.1 总RNA及反转录cDNA模板检测
  • 4.1.1 总RNA的甲醛变性胶电泳检测结果
  • 4.1.2 cDNA模板质量及引物扩增效果的检测
  • 4.2 PNAS-4基因cDNA全长的获得
  • 4.2.1 获得完整的5’UTR
  • 4.2.2 扩增填补cDNA序列中的gap
  • 4.3 PNAS-4基因的mRNA结构特点
  • 4.4 PANS-4蛋白质结构特点
  • 4.4.1 保守功能结构域DUF862
  • 4.4.2 蛋白质结构的保守性
  • 4.5 PNAS-4基因组结构特点
  • 4.5.1 第二内含子多态检测
  • 4.5.2 3’UTR多态检测
  • 4.5.3 基因组序列遗传变异分析
  • 4.6 PNAS-4染色体位置与QTLs关联分析
  • 4.7 人的同源基因启动子结构特点
  • 4.8 Real-time PCR结果分析
  • 4.8.1 组织表达谱分析
  • 4.8.2 组织和细胞中该基因的表达差异
  • 4.8.3 骨胳肌不同发育阶段表达谱结果分析
  • 4.9 原核表达结果
  • 4.9.1 表达质粒P4-pET28c的酶切鉴定
  • 4.9.2 表达质粒P4-pET28c在大肠杆菌中的表达结果
  • 4.10 蛋白质CGI-146亚细胞定位
  • 4.10.1 荧光表达质粒P4-pGFP的酶切鉴定
  • 4.10.2 利用荧光表达载体进行亚细胞定位结果
  • 4.11 超表达结果
  • 4.11.1 超表达质粒P4-pcDNA3.1的酶切鉴定结果
  • 4.11.2 对该基因进行超表达后的实验结果
  • 5 讨论
  • 5.1 关于RNA的质量问题
  • 5.2 结构与功能关系讨论
  • 5.2.1 关于mRNA的结构功能域
  • 5.2.2 关于蛋白质序列的功能元件
  • 5.2.3 关于猪的PNAS-4基因组的结构特点
  • 5.2.4 关于启动子区域的调控因子
  • 5.3 基因表达谱的讨论
  • 5.3.1 关于组织表达谱
  • 5.3.2 关于正常组织与癌化细胞表达差异的讨论
  • 5.3.3 关于骨胳肌不同发育时期表达谱的讨论
  • 5.3.4 关于RT-PCR与Real-time PCR方法的讨论
  • 5.4 原核表达无特异产物的原因
  • 5.5 亚细胞定位结果的讨论
  • 5.6 关于凋亡实验结果的讨论
  • 6 小结
  • 6.1 已经获得的结果
  • 6.2 本研究的创新点与特色
  • 6.3 本研究的不足
  • 6.4 由本研究引出的问题
  • 第二部分 猪α1,3-GT基因敲除载体的构建
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1 文献综述
  • 1.1 器官移植
  • 1.2 异种器官移植
  • 1.2.1 异种器官移植概述
  • 1.2.2 异种动物供体的选择
  • 1.2.3 异种移植障碍
  • 1.2.4 抑制α1,3-GT表达的应对措施
  • 1.3 α1,3-GT基因的研究进展
  • 1.3.1 α1,3-GT的特性
  • 1.3.2 猪的α1,3-GT研究情况
  • 1.3.3 其它哺乳动物α1,3-GT的研究情况
  • 2 目的与意义
  • 3.材料与方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 DNA样品
  • 3.1.2 克隆及打靶载体
  • 3.1.3 生化试剂
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 NaCl盐析法提取长片段基因组DNA
  • 3.2.2 短臂扩增与连接
  • 3.2.3 长臂扩增与连接
  • 3.2.4 打靶载体的线性化
  • 4 结果与分析
  • 4.1.PCR扩增用的DNA模板
  • 4.2 打靶载体的构建
  • 4.2.1 短臂的酶切鉴定
  • 4.2.2 长臂的扩增、克隆及酶切鉴定
  • 4.2.3 打靶载体PLS-pPNT的酶切鉴定
  • 5 讨论
  • 5.1 长片段DNA的克隆与酶切连接问题
  • 5.2 基因打靶载体构建的理论分析
  • 6 小结
  • 6.1 已经获得的结果
  • 6.2 本研究的创新点与特色
  • 6.3 本研究的不足之处
  • 6.4 关于本研究后续实验的建议
  • 参考文献
  • 附录1 缩略词表
  • 附录2 主要性状的中英文对照和缩写
  • 附录3 在读期间发表论文题录
  • 致谢

    • 相关论文文献

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