芳基乙腈类腈水解酶酶源的筛选及其在合成对甲氧基苯乙酸中的应用

论文摘要

腈类化合物的酶法水解在羧酸、酰胺的合成中扮演着越来越重要的角色,因此腈转化酶也越来越受到人们的关注,需求量也越来越大。本论文的目标产物对甲氧基苯乙酸是一种具有高附加值的有机合成及医药中间体,目前都采用化学法生产。微生物法制备对甲氧基苯乙酸具有反应条件温和、环境友好、转化率高、符合“绿色化学”要求等优点。本论文围绕静息细胞生物催化对甲氧基苯乙腈合成对甲氧基苯乙酸的工艺路线,从目标生物催化剂的发现、表征、制备与应用等环节展开了几方面的研究和探讨。论文首先确立了以对羟基苯乙腈为唯一富集氮源、薄层色谱法（TLC）定性检测产物的高通量筛选模型。通过该模型,筛到了11株具有催化对甲氧基苯乙腈为对甲氧基苯乙酸能力的菌株,其中以编号ZJB-063的菌株催化活性最高。通过形态学、生理生化试验、Biolog鉴定系统、16S rDNA序列及系统发育分析。该菌株（ZJB-063）被鉴定为Bacillus subtilis,这是该种内首次报道的产腈水解酶的菌株。通过单因素和响应面法对B.subtilis ZJB-063产腈水解酶的培养基成分进行了优化。确定了较适宜的培养基组成为（g/l）:葡萄糖12.6,酵母粉6.6,（NH4）2SO45.5,K2HPO40.5,KH2PO40.5,MgSO40.5,FeSO4·7H2O 0.01。B.subtilis ZJB-063适宜的产酶条件为:温度30℃,初始pH 7.0,接种量4%（v/v）,装液量20%。在上述条件下,培养40 h,腈水解酶的活力达到17.24 U/g。论文考察了静息细胞催化对甲氧基苯乙腈的过程,评估了微环境因素对酶活的影响。结果表明,最适宜的缓冲体系是磷酸盐溶液,最适pH为7.0;该腈水解酶的最适转化温度为32℃,其热稳定性较差,30和35℃下的半衰期分别为92.6和24.0 h;浓度为15 mM的底物或产物对该酶均有较明显的抑制作用;金属离子对该腈水解酶酶活无促进作用,巯基结合试剂如CuCl2和AgNO3强烈抑制酶活力（抑制率达到84.21和92.26%）,说明该酶的活性中心至少需要一个以上的巯基;转化体系中添加5%的甲醇和二甲基亚砜后,酶活力分别提高35.15和62.70%。在优化的反应条件下,10 mM对甲氧基苯乙腈于4 h内转化完全,腈水解酶的最高比活力为20.81 U/g,比优化前（17.24 U/g）提高了17.16%。对酶促反应动力学参数的研究发现,细胞的Km、Vm和Ks值分别为0.714 mmol/l、0.061mmol/（l·min）和13.601mmol/l。论文在考察诱导剂对B.subtilis ZJB-063产酶的影响时发现,该菌株是一株产多种腈转化酶的菌株,腈的两条转化途径可以同时存在该菌株内。该菌株腈水解酶的产生不需添加诱导剂,因此其可能是组成型的腈水解酶。由于该酶底物特异性较强,只催化芳基乙腈类化合物,因此属于芳基乙腈类腈水解酶。当产酶培养基中添加己内酰胺时,菌株B.subtilis ZJB-063产腈水合酶和酰胺酶,它们的底物范围较广,能催化所考察的各种结构的腈类化合物（β-氨基丙腈除外）。论文最后采用海藻酸钙包埋B.subtilis ZIB-063,以提高细胞的重复使用性能。从提高机械强度和酶活力的角度,优化了海藻酸钙固定化细胞的制备条件,确定最佳制备条件为:海藻酸钠浓度2.5%,CaCl2浓度4%,固定化时间4 h,颗粒直径2 mm。考察了海藻酸钙固定化细胞的反应条件,结果表明,固定化细胞的最适pH为7.4,最适转化温度为32℃。细胞经固定化后,腈水解酶的热稳定性得到提高,但酶活有所降低,10 mM的对甲氧基苯乙腈在7 h内被转化完全。固定化细胞重复使用8批后,活力可保持初始的85%,但是之后发生颗粒膨胀、细胞泄漏的现象。针对上述现象,论文采用聚乙烯亚胺和戊二醛强化固定化颗粒,确定最佳的聚乙烯亚胺、CaCl2和戊二醛浓度分别为0.2%、40 mM和0.8%,最佳的戊二醛交联时间为30 s。固定化细胞经强化后,其抗磷酸盐能力和机械强度得到较大提高;酶活略有下降,10 mM的对甲氧基苯乙腈可在10 h内被转化完全;重复使用性能提高,反应17批后酶活仍为最初的68.32%。环境扫描电镜（ESEM）观察发现强化后固定化颗粒表面和内部的细胞分布比未经强化的密集,究其原因,可能是固定化颗粒强化后体积缩小,单位体积细胞的密度增大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生物催化
• 1.2 腈类化合物及其它的生物转化
• 1.3 腈转换酶
• 1.4 腈水解酶
• 1.4.1 腈水解酶的来源及性质
• 1.4.2 腈水解酶的底物特异性
• 1.4.3 酶的结构
• 1.4.4 反应机理
• 1.4.5 腈水解酶的应用
• 1.5 对位取代的芳基乙酸类化合物
• 1.5.1 芳基乙酸类化合物的用途
• 1.5.2 对位取代芳基乙酸类物质的合成方法
• 1.6 本论文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 产腈水解酶菌种的筛选与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 土样
• 2.2.2 化学试剂与主要仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 菌种的初筛
• 2.2.5 菌种的复筛
• 2.2.6 菌种的确定
• 2.2.7 菌种的生理生化鉴定
• 2.2.8 16S rDNA的分子生物学鉴定
• 2.2.9 系统发育学分析
• 2.2.10 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 筛选结果
• 2.3.2 菌株ZJB-063的鉴定
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 腈水解酶产生菌B.subtilis ZJB-063培养条件的优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 菌体培养
• 3.2.4 菌体制备
• 3.2.5 生物量测定
• 3.2.6 静息细胞转化
• 3.2.7 酶活的定义
• 3.2.8 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 产酶培养基成分的优化
• 3.3.2 其它培养条件对菌体生长和产酶的影响
• 3.3.3 优化条件下的菌体生长及产酶曲线
• 3.4 本章小节
• 参考文献
• 第四章 B.subtilis ZJB-063静息细胞催化对甲氧基苯乙腈生产对甲氧基苯乙酸反应条件的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种与培养基
• 4.2.2 静息细胞的制备
• 4.2.3 静息细胞转化
• 4.2.4 酶活的定义
• 4.2.5 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 pH的影响
• 4.3.2 反应温度对酶活的影响
• 4.3.3 细胞浓度对酶活的影响
• 4.3.4 底物浓度对酶活的影响
• 4.3.5 产物浓度对酶活的影响
• 4.3.6 共溶剂对酶活的影响
• 4.3.7 金属离子对酶活的影响
• 4.3.8 转化时间对酶活的影响
• 4.3.9 反应动力学参数的确定
• 4.3.10 500ml鼓泡式反应器中对甲氧基苯乙酸的合成
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 B.subtilis ZJB-063中的腈转化酶及酶解途径的探索
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 化学试剂
• 5.2.2 菌种
• 5.2.3 培养基和培养条件
• 5.2.4 菌体培养
• 5.2.5 菌体制备
• 5.2.6 生物量测定
• 5.2.7 静息细胞转化
• 5.2.8 B.subtilis ZJB-063中的不同酶系及它们的底物特异性
• 5.2.9 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 添加各种腈类、酰胺类及羧酸类化合物对B.subtilis ZJB-063产酶和菌体生长的影响
• 5.3.2 B.subtilis ZJB-063酶解途径
• 5.3.3 B.subtilis ZJB-063胞内腈水解酶的热稳定性
• 5.3.4 B.subtilis ZJB-063腈水解酶的底物特异性
• 5.3.5 取代基效应的Hammett线性自由能方程
• 5.3.6 B.subtilis ZJB-063腈水合酶/酰胺酶的底物特异性
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 固定化B.subtilis ZJB-063生产对甲氧基苯乙酸
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 化学试剂
• 6.2.2 微生物及培养条件
• 6.2.3 固定化细胞的制备方法
• 6.2.4 固定化细胞生物催化制备对甲氧基苯乙酸
• 6.2.5 海藻酸钠固定化细胞制备的条件优化
• 6.2.6 海藻酸钠固定化细胞的转化条件研究
• 6.2.7 固定化细胞批次转化制备对甲氧基苯乙酸
• 6.2.8 固定化细胞机械强度测定
• 6.2.9 分析方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 固定化方法的确定
• 6.3.2 固定化细胞转化条件的研究
• 6.3.3 固定化细胞生物合成对甲氧基苯乙酸的进程曲线
• 6.3.4 固定化细胞反应批次试验
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 第七章 海藻酸钙固定化颗粒的强化
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 化学试剂
• 7.2.2 微生物及培养条件
• 7.2.3 海藻酸钙固定化细胞的制备
• 7.2.4 聚乙烯亚胺（PEI）和戊二醛（GA）强化海藻酸钠固定化颗粒
• 7.2.5 强化参数优化
• 7.2.6 固定化强化细胞生物催化制备对甲氧基苯乙酸
• 7.2.7 固定化细胞批次转化制备对甲氧基苯乙酸
• 7.2.8 固定化细胞耐磷酸盐能力的测定
• 7.2.9 固定化细胞机械强度测定
• 7.2.10 底物和产物的HPLC检测法
• 7.2.11 固定化载体的微观结构观察
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 聚乙烯亚胺强化后固定化细胞耐磷酸盐能力的变化
• 7.3.2 强化过程参数的影响
• 7.3.3 聚乙烯亚胺和戊二醛处理对固定化细胞酶活的影响
• 7.3.4 强化后固定化细胞的重复使用性能
• 7.3.5 聚乙烯亚胺对固定化细胞pH值的影响
• 7.3.6 固定化颗粒的微观结构观察
• 7.4 本章小结
• 参考文献
• 第八章 结论与展望
• 8.1 结论
• 8.2 展望
• 攻读博士学位期间发表论文情况
• 致谢