稀有鮈鲫角蛋白18基因全序列和启动子的克隆及转基因技术在荧光稀有鮈鲫培育上的应用

论文摘要

我国是世界水产大国,将转基因等现代生物技术引入传统的水产养殖中,已成为必然的发展趋势。现代生物技术,在观赏水族业中,更具应用前景。随着组织特异性启动子研究的深入,用荧光基因构建重组子,并转入鱼受精卵中,获得在不同部位发荧光的转基因观赏鱼技术已经得到初步应用。稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）是我国特有的一种小型鲤科鱼类,并已作为一种新型的模式实验鱼应用于鱼类遗传学、鱼病学、环境科学以及转基因观赏鱼等研究领域。其所具有的优良特性使其具备通过转基因技术开发培育类似于斑马鱼（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）等观赏鱼的潜在可能性。角蛋白18是角蛋白的一种,属于S型角蛋白,是在哺乳动物和两栖类动物胚胎发育中第一个表达的中间纤维蛋白。本研究根据已发表的人、爪蟾及斑马鱼角蛋白18 DNA序列,通过DNAman同源性比较获得保守序列,并从中设计二对引物。从稀有鮈鲫基因组中PCR扩增得到2779 bp的角蛋白18的DNA序列片段;通过基因组步移,分别获得该基因的上游和下游序列片段;最后将获得的全基因片段克隆至质粒载体pMD19-T进行序列测定检验。结果显示所克隆的稀有鮈鲫角蛋白18基因全长3765 bp。对该基因进行NCBI的Blastn同源性比较分析,表明稀有鮈鲫同斑马鱼比较角蛋白18 DNA序列存在73.6%同源相似性;同时对该基因进行生物学分析,ORF预测表明稀有鮈鲫角蛋白18是含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸的蛋白质。转座子是存在于DNA上,可以自主复制和可移动的遗传元件的基本单位,它存在于生物界的各个领域,转座子及其相关技术是后基因组时代用于研究基因组功能的生物技术。将克隆得到的角蛋白18启动子片段克隆到红色荧光表达载体和含转座酶基因表达载体上。通过显微注射将重组表达载体导入脱粘的稀有鮈鲫受精卵中,利用荧光显微镜能观察到红色荧光蛋白的表达,表明所克隆的稀有鮈鲫角蛋白18基因启动子片段具有一定的转录活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 转基因鱼研究概况
• 1. 转基因鱼中常用的基因介绍
• 2 启动子的克隆方法
• 3. 基因转移的方法
• 3.1 显微注射法
• 3.2 精子载体法
• 3.3 电穿孔法
• 3.4 逆转录病毒感染法
• 3.5 转座子法
• 4. 转基因鱼的应用前景
• 第二章 基因组步移技术克隆稀有鮈鲫角蛋白18 基因序列及序列分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 稀有鮈鲫基因组DNA 的提取
• 1.2.2 引物设计与合成
• 1.2.3 PCR 扩增和扩增产物检测
• 1.2.4 PCR 产物回收
• 1.2.5 与T 载体连接
• 1.2.8 序列测定和分析
• 1.3 基因组步移法扩增稀有鮈鲫keratin 18 上游和下游序列
• 1.3.1 引物设计
• 1.3.2 稀有鮈鲫基因组DNA 的酶切检测
• 1.3.3 稀有鮈鲫基因组DNA 的大量酶切构建基因组步移文库
• 1.3.4 基因组DNA 酶切产物的纯化
• 1.3.5 纯化后的酶切产物与Genomewalker Adaptor 连接
• 1.3.6 PCR 扩增
• 1.3.7 序列分析
• 2 .结果与分析
• 2.1 稀有鮈鲫角蛋白18 基因的部分序列的克隆
• 2.2 稀有鮈鲫角蛋白18 基因步移结果
• 2.3 稀有鮈鲫角蛋白18 基因序列在NCBI 上的搜索
• 2.4 GC 含量分析
• 2.5 稀有鮈鲫角蛋白18 基因序列开放阅读框的分析预测
• 2.6 稀有鮈鲫角蛋白18 的三维结构
• 3 讨论
• 3.1 稀有鮈鲫角蛋白18 基因序列与斑马鱼角蛋白18 基因序列的比较
• 3.2 角蛋白的特性与功能
• 第三章 稀有鮈鲫角蛋白18 基因启动子的克隆和分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 稀有鮈鲫基因组DNA 的提取
• 1.2.2 引物设计与合成
• 1.2.3 基因组步移文库的构建
• 1.2.4 稀有鮈鲫基因组DNA 的酶切检测
• 1.2.3 稀有鮈鲫基因组DNA 的大量酶切构建基因组步移文库
• 1.2.5 纯化后的酶切产物与Genomewalker Adaptor 连接
• 1.2.6 PCR 扩增
• 1.2.7 序列分析
• 2. 结果
• 2.1 步移的结果
• 2.2 稀有鮈鲫角蛋白18 基因启动子序列拼接
• 2.3 稀有鮈鲫角蛋白18 启动子序列经分析得到的各个调控因子的序列
• 3. 讨论
• 第四章 红色荧光蛋白表达载体以及转红色荧光蛋白基因稀有鮈鲫的构建
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和克隆载体
• 1.1.2 酶与试剂盒
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 启动子的PCR 改造及产物回收
• 1.2.3 PCR 回收产物的酶切
• 1.2.4 红色荧光蛋白基因质粒和含转座酶基因质粒的酶切
• 1.2.4.1 红色荧光蛋白表达载体质粒和含转座酶基因质粒的转化
• 1.2.4.2 蓝白斑初步筛选转化子
• 1.2.4.3 红色荧光蛋白表达载体质粒和含转座酶基因质粒的抽提
• 1.2.4.4 红色荧光蛋白表达载体质粒和含转座酶基因质粒的酶切
• 1.2.5 两种酶切方式的启动子和两种质粒酶切后纯化回收
• 1.2.5.1 两种酶切方式的启动子纯化
• 1.2.5.2 两种质粒酶切后载体大片段的回收和纯化
• 1.2.6 红色荧光蛋白表达载体的构建
• 1.2.6.1 启动子与红色荧光蛋白表达载体的连接
• 1.2.6.2 重组载体的转化及筛选
• 1.2.7 稀有鮈鲫的饲养及配对
• 1.2.8 显微注射及转基因稀有鮈鲫的培养
• 1.2.9 荧光显微镜初步检测RFP 的表达
• 2. 结果与分析
• 2.1 启动子的PCR 改造及内切酶消化
• 2.2 重组红色荧光蛋白载体和含转座酶基因载体的双酶切鉴定
• 2.3 RFP 在转基因稀有鮈鲫中的表达
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢