重组腺病毒介导DN-JNK1干预SD大鼠非酒精性脂肪肝病细胞凋亡及作用机理

论文摘要

目的：应用表达失活型c-jun氨基激酶1的重组腺病毒（recombinant adenovirus expressing dominant negative type c-Jun N-terminal kinasel, Ad-DN-JNK1）,对非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）大鼠进行干预,观察其改善肝细胞凋亡的效果,并对JNK1引起NAFLD肝细胞凋亡的可能机制进行初步探讨。方法：完全随机法将48只SD大鼠分为2组,正常饮食组（normal diet group, NG） 16只和高脂饮食组（high-fat diet group, HG）32只,对照组喂普通饲料,高脂组喂高脂饲料。第8w末随机从NG和HG各抽取8只大鼠,门静脉抽血和留取肝组织行病理检查鉴定成模。余下的8只NG大鼠继续喂养普通饲料至12w末称为12w对照组（NG12w）,余下的24只HG大鼠随机分为12w高脂（HG12w）、携带绿色荧光蛋白的腺病毒（recombinant adenovirus expressing green fluorescence protein,Ad-GFP）组、Ad-DN-JNK1组,每组各8只,继续喂养高脂饲料,上述四组喂养至12w末。第8w末,NG12w组及HG12w大鼠均尾静脉注入1ml生理盐水作为安慰剂组对照,Ad-GFP组大鼠尾静脉注入1ml 2.0×1010pfu的Ad-GFP作为腺病毒对照,Ad-DN-JNK1组大鼠尾静脉注入1ml 2.0×1010pfu的Ad-DN-JNK1作为治疗组。处死前隔夜禁食并称重；每只大鼠经门静脉取血,离心分离血清,用于测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、空腹血糖（FBS）、血清胰岛素（FIns）、游离脂肪酸（FFAs）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）；计算空腹胰岛素抵抗指数（FIRI）;游离肝脏并称重,计算肝指数；取小块肝组织剪碎,倒入玻璃匀浆器中匀浆,制成10%的肝组织匀浆,用于测定肝匀浆FFAs、SOD、MDA含量；取大鼠肝右叶组织行病理切片,HE染色,评价肝脏脂肪变性程度。并制作石蜡切片,用免疫组织化学方法检测JNK1在肝组织中的表达。TUNEL法检测肝细胞凋亡。结果：（1）HG大鼠体重、肝指数、血清ALT、AST、TG、TC、FIns、FIRI、FFAs、TNF-α水平及肝匀浆FFAs、MDA, JNK1蛋白表达,凋亡细胞数量与同期正常对照组比较明显升高,肝匀浆SOD降低,差异均具有统计学意义（p均<0.05）；而FBS没有明显变化,差异无统计学意义（p>0.05）；Ad-GFP和HG12w大鼠比较,上述各项指标比较,差异无统计学意义（p均>0.05）。（2）与HG12w及Ad-GFP组大鼠比较,Ad-DN-JNK1组的体重、肝指数、血清ALT、AST、TG、TC、FIns、FIRI、FFAs、TNF-α水平及肝匀浆FFAs、MDA下降,SOD升高,JNK1蛋白表达降低,凋亡细胞数量明显减少,差异均具有统计学意义（p均<0.05）。Ad-DN-JNK1组与NG12w大鼠比较,体重、肝指数、血清AST、FIns、FIRI差异均无统计学意义（p均>0.05）。其余血清学及肝匀浆指标、JNK1蛋白表达水平、凋亡细胞数量未恢复到正常水平,差异均具有统计学意义（p均<0.05）。（3）光镜下,HG8w大鼠肝脏出现空泡样脂肪变性,HG12w大鼠肝脏空泡样脂肪变性呈弥漫性,伴有炎症细胞浸润；Ad-GFP和HG12w大鼠均进展为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）;而Ad-DN-JNK1组大鼠肝脏脂肪变性明显改善,未出现炎症反应。（4）JNK1的蛋白表达强度与肝细胞凋亡水平呈正相关（Pearson相关系数为0.822,P<0.01）。结论：1.SD大鼠高脂饲料持续喂养8周可形成单纯性脂肪肝,12周可形成NASH;2.高脂饮食可诱导肝组织JNK1蛋白表达增加,凋亡细胞的数量增多,随着时间延长逐渐加重,呈现时间依赖性。且JNK1蛋白表达与肝凋亡细胞数量呈明显正相关。3.应用Ad-DN-JNK1重组腺病毒治疗SD大鼠NAFLD,可明显改善肝组织脂肪变性及减少肝细胞凋亡,可能成为治疗NAFLD的新靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 前言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 实验动物及分组
• 1.2 饲料配制
• 1.3 主要试剂及仪器
• 1.4 Ad-DN-JNK1的来源
• 1.5 一般情况的观察
• 1.6 肝指数的计算
• 1.7 标本的提取
• 1.8 生化指标的检测
• 1.9 IR程度的评价
• 1.10 肝组织病理学评价
• 1.11 JNK1免疫组织化学检测
• 1.12 TUNEL检测肝细胞凋亡
• 1.13 统计学分析
• 第二章 实验结果
• 2.1 各组大鼠一般情况及体重、肝指数的变化
• 2.2 各组大鼠肝组织病理学检查
• 2.3 各组大鼠血清FBS、FINS、FIRI的变化
• 2.4 各组大鼠肝脏转氨酶、血脂的变化
• 2.5 各组大鼠血清、肝匀浆FFAs的变化
• 2.6 各组大鼠肝匀浆SOD、MDA的变化
• 2.7 各组大鼠血清TNF-α的变化
• 2.8 各组大鼠肝脏JNK1免疫组化结果
• 2.9 各组大鼠肝脏细胞凋亡检测结果
• 2.10 肝组织JNK1蛋白表达与细胞凋亡水平的相关性分析
• 第三章 讨论
• 3.1 NAFLD大鼠模型的构建
• 3.2 NAFLD肝细胞凋亡的发病机制
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢