心室重构和心肌凋亡对冠状动脉微栓塞后心功能不全的影响及机制

论文摘要

第一部分小型猪冠状动脉微栓塞后早期左室重构的发生及其与TGF-β1/Smad3的相关性研究背景冠状动脉微栓塞（CME）是冠脉斑块破裂或冠脉介入治疗术后的一种严重且常见的并发症。既往的动物研究已经证实,冠脉微栓塞虽然不足以引起冠脉血流的明显下降,甚至可能引起短暂性的血流升高（腺苷一过性释放引起血管扩张）,但是CME可诱发局部心肌的炎症反应,使TNF-α、MCP-1等炎症因子表达增强,出现心肌灌注和心功能不匹配、冠脉血流储备下降、冠脉阻抗增大及心功能的进行性下降。转化生长因子-β1（TGF-β1）,作为一种重要的细胞因子,参与多种生理性和病理性反应,如细胞生长、分化、纤维化发生、血管生成等。但TGF-β1是否参与冠脉微栓塞后的早期心功能下降及心室重构尚不确定。研究目的本实验的目的是通过构建猪冠状动脉微栓塞模型,明确冠脉微栓塞后早期的心功能及心室重构的发生,并通过分子生物学的技术,探究TGF-β1及其下游因子Smad3的表达,分析血清TGF-β1与心室重构、心功能的相关性。研究方法18只雌雄不拘的小型猪（CME组15只；假手术组3只）,通过冠脉介入的方法,于前降支的中远段注入惰性微栓塞球12万单位（直径42μm）,从而建立冠脉微栓塞模型。通过高场强（3.0T）磁共振扫描仪评估微栓塞术前、术后6小时及术后1周心功能,分别测量LVEF、LVESV、LVEDV等指标,同时检测首过灌注和延迟扫描时心肌强化灶。术后1周处死并取出心脏,沿房室沟水平切片,行心肌NBT染色,同时制备心肌石蜡切片用以免疫组织化学染色。通过ELISA测量血清TGF-β1、IL-6和TNF-α;免疫比浊法测量Troponin T （cTnT）水平；应用蛋白免疫印迹法（western blot）和免疫组织化学法检测心肌组织的TGF-β1和Smad表达；同时应用Realtime-PCR的方法检测心肌TGF-β1、Smad3的mRNA水平。此外,通过三色染色法检测心肌组织内的胶原水平。研究结果应用高场强（3.0T）MRI在不同时间点进行心脏检测发现,与假手术组的结果相比,CME组冠脉微栓塞术后6小时的LVEDV（45.4ml vs.38.8ml, P<0.05）、LVESV（20.2ml vs.15.3ml,P<0.05）逐渐增大,术后6小时的LVEF则明显下降（55.5% vs.60.6%,P<0.05）；术后1周时,微栓塞组LVEF值略有恢复,但与假手术组相比仍有显著下降（56.4% vs.62.1%,P<0.05）。血清TGF-β1术后2小时即开始升高,术后6小时达峰值（相比于术后2小时,P<0.05）,术后1周时TGF-β1虽然略有下降,但仍明显高于基础值（P<0.01）。而血清TNF-α在术后2小时即明显升高并达峰值,术后6小时则开始下降,术后1周时已降至基础水平。另外一种炎症因子IL-6,在术后2小时明显升高,术后6小时达峰值,其在术后1周降至术前水平。心肌损伤标志物cTnT在术后2小时开始升高,在术后6小时最明显（相比于术后2小时,P<0.05）。术后1周时,血清cTnT水平已下降,但仍高于基础值。通过相关性分析,我们发现血清TGF-β1水平与LVESV （r= 0.409）、LVEDV（r=0.532）存在正相关,与LVEF（r=-0.438）存在负相关。作为心肌损伤标志物之一的Troponin T也与LVEDV、LVESV、LVEF存在上述相似的相关性。而TNF-α与IL-6与上述心室内径、射血分数未见明显相关性。Realtime-PCR结果显示术后1周的前壁心肌组织（微栓塞相关心肌）TGF-β1及Smad3 mRNA表达增强；Western blot和免疫组织化学检测也证实上述两者表达明显高于后壁心肌（非微栓塞相关心肌）。同时应用三色染色法染色心肌石蜡切片发现,术后1周时,前壁心肌内胶原表达明显高于后壁心肌组织。研究结论心肌左室重构在冠脉微栓塞术后早期即已开始发生,同时心室重构的发生可能与TGF-β1/Smad3的表达增强有关。第二部分TNF-α介导的心肌凋亡对冠状动脉微栓塞后心肌收缩功能不良的影响及机制研究背景近来的实验性研究证实,TNF-α在冠状动脉微栓塞（CME）后心功能不全的发生发展中起了重要作用。另外,TNF-α参与介导的心肌凋亡作为心功能不全的一种病理机制亦受到广泛重视。然而,在冠脉微栓塞后是否存在心肌的凋亡,尚不明确。同时,TNF-α所介导的心肌凋亡是否参与冠脉微栓塞后的心功能减退也未得到证实。研究目的本实验的目的是证实冠状动脉微栓塞后心肌的凋亡情况及微栓塞相关性局部心肌的收缩功能,同时应用TNF-α抗体阿达木单抗治疗冠脉微栓塞来探究TNF-α介导的心肌凋亡是否参与了冠脉微栓塞后心肌收缩功能的进行性下降。研究方法本实验选用16只雌雄不拘的小型猪（体重20-25kg）,冠脉微栓塞的模型通过冠脉介入的方法,经冠脉内注射42μm的微栓塞球（总量12万个）来制备。实验共分三组：微栓塞组（8只）,在CME术前20min经冠脉内注入10ml生理盐水；治疗组（5只）,在CME前20min经冠脉内注入阿达木单抗（2mg/kg）;假手术组（3只）,单纯经冠脉注入10ml生理盐水,而不注入微栓塞球。所有小型猪在CME术前、术后6小时、术后1周时进行心肌组织多普勒检测,分析前壁心肌收缩峰值速度（S波）,评估微栓塞相关局部心肌的收缩功能。应用ELISA法检测血清TNF-α水平；应用western blot和免疫组织化学法检测微栓塞相关性前壁心肌组织的TNF-α蛋白表达水平。与此同时,以TUNNEL法检测前壁心肌组织的凋亡细胞核；并应用Realtime-PCR的方法检测TNF-α、caspase3的mRNA表达。研究结果通过组织多普勒技术评估冠脉微栓塞相关的前壁心肌收缩峰值速度（S波）发现,术后6小时,在假手术组、单纯微栓塞组、阿达木单抗治疗组间的收缩峰值速度未见显著性差异（1.51cm/s,1.45cm/s,1.44cm/s,P>0.05）；术后1周时,单纯微栓塞组的前壁收缩峰值速度明显低于假手术组（1.20cm/s vs.1.50cm/s,P<0.01）,而阿达木单抗治疗组,术后1周的前壁收缩峰值速度与单纯微栓塞组相比,有明显的改善（1.39cm/s vs.1.20cm/s, P<0.05）。ELISA的血清学检测发现,与假手术组相比,冠脉微栓塞组术后2小时,血清TNF-α即开始明显升高（337.52±49.18pg/ml vs.122.50±32.32 pg/ml,P<0.05）,1周后降至正常水平（100.11±22.12pg/ml vs.103.27±28.93 pg/ml,P>0.05）：而阿达木单抗治疗组的血清TNF-α变化趋势与单纯微栓塞组基本相似（术后2小时：304.11±38.41 pg/ml vs.337.52±49.18 pg/ml;术后1周：102.19±20.32 pg/ml vs.100.11±22.12 pg/ml, P>0.05）。研究还发现,在单纯微栓塞组,术后1周时前壁心肌组织内不仅TNF-a mRNA和TNF-a蛋白的表达显著高于假手术组,而且caspase3的mRNA表达和TUNNEL检测发现的凋亡细胞核数均明显高于假手术组（22.0±3.0/视野vs.3.0±2.0/视野,P<0.01）。而在阿达木单抗治疗组（TNF-a抗体-2mg/kg）,虽然治疗组的前壁心肌内TNF-a mRNA和TNF-a蛋白的表达未见明显下降,但是前壁收缩峰值速度明显高于单纯微栓塞组,（1.39cm/s vs.1.20cm/s, P<0.05）,同时凋亡细胞数也明显下降（12.0±4.0 vs.22.0±3.0,P<0.01）。研究结论TNF-a介导的心肌凋亡可能参与冠脉微栓塞后的局部心肌收缩功能减退；而在冠脉微栓塞术前经冠脉注射TNF-a抗体可改善心肌收缩功能不全的进展。第三部分择期冠脉支架植入术后cTnT升高患者的危险因素分析及其与术后血清TNF-α水平的相关性研究背景择期冠状动脉支架植入术后cTnT水平的升高是预测近期和远期主要心血管事件的因素,其发生可能由支架内血栓、分支血管闭塞、冠脉痉挛、无复流、冠脉微栓塞所致。目前对择期冠脉支架术后cTnT升高的危险因素认识尚不足。研究目的本研究拟通过分析择期冠状动脉支架植入术后患者血清cTnT升高的危险因素,以及术后cTnT变化和TNF-α水平的相关性,从而为预防和早期识别冠脉微栓塞提供新的方法。研究方法入选2010年5月至2010年10月在我院行择期冠脉支架植入术的患者。将术后cTnT升高组（59例）和cTnT正常组（108例）进行比较,分析临床因素（性别、年龄、高血压病、高脂血症、2型糖尿病、吸烟史、冠心病家族史）、实验室检测数据（血肌酐、血尿酸、血胆固醇、甘油三酯）、冠脉相关因素（冠脉病变血管数、本次手术植入支架数、冠脉严重度积分-Gensini积分）与术后cTnT升高的关联。分别应用单因素分析（t检验或卡方检验）、多因素分析（二元Logistic回归）的方法,对支架植入术后cTnT的危险因素进行分析；应用Spearman相关性检验,分析术后血清cTnT和TNF-α水平的关联。研究结果本研究共入组167位患者,其中男性123位（占73.7%）,女性44位（26.3%）。所有患者术前cTnT、CK、CK-MB均在正常范围。在冠脉支架植入术后即刻,行多体位复查冠状动脉造影,均未发现支架内血栓、分支血管闭塞、TIMI血流受损、无复流发生、冠状动脉痉挛、主支及分支血管夹层形成等现象。实验分组：术后cTnT升高组（>0.03ng/ml）共59例,术后cTnT正常组共108例。单因素分析发现,年龄、高血压病、血总胆固醇、病变血管支数、本次手术植入支架数、Gensini积分是择期冠脉支架植入术后cTnT升高的危险因素；经二元Logistic多因素回归分析,发现年龄、高血压病、血总胆固醇、病变血管支数、本次手术植入支架数是术后cTnT升高的独立危险因素,其中高血压病、病变血管支数、本次植入支架数、血胆固醇分别使得PCI术后cTnT升高的危险性增加172%、128%、87%、58%。相关性分析还发现,冠脉支架植入术后血清cTnT与TNF-α水平的显著正相关,r=0.493,P<0.01。研究结论年龄、高血压病、血总胆固醇、病变血管支数、本次手术植入支架数是术后cTnT升高的独立危险因素,以上因素可能与冠脉微栓塞发生的相关。支架术后血清TNF-α与cTnT呈明显正相关,前者可作为冠脉微栓塞早期识别和诊断的生物学标志物之一。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 参考文献
• 第一部分
• 前言
• 实验材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分
• 前言
• 实验材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分
• 前言
• 实验资料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 学术成果
• 致谢