内质网应激在糖尿病心肌病发病机制中作用的实验研究

论文摘要

第一部分内质网应激与糖尿病心肌病心肌细胞凋亡关系的实验研究背景随着糖尿病发病率的逐年上升,其并发症糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy,DCM）也日益受到重视,它往往发生于动脉粥样硬化之前,其临床表现为早期心脏舒张功能受损,晚期收缩功能受损,最终发展为心力衰竭。DCM作为一个慢性复杂的病理过程,造成细胞代谢紊乱,并影响到细胞器如线粒体、内质网、肌纤维内膜等的正常功能。DCM的发病机制非常复杂,涉及到代谢紊乱、心肌细胞肥大、细胞凋亡增加、心肌纤维化、自主神经功能紊乱、小血管病变、胰岛素抵抗等多种机制,其中,心肌细胞肥大、凋亡增多是DCM最重要的病理改变之一,但其具体机制尚未明了。近期有报道糖尿病大鼠心肌细胞凋亡增多,提示凋亡在糖尿病心肌病发病可能起到重要作用。而内质网应激是近年来新发现的介导细胞凋亡的途径之一。内质网（endoplasmic reticulum,ER）是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞内钙离子的储存场所,蛋白在内质网腔形成空间结构由许多分子伴侣蛋白协助,包括糖调解蛋白（glucose-regulated protein）GRP78和GRP94。内质网应激（endoplasmicreticulum stress,ERS）已证明在糖尿病病人体内普遍存在,可由多种原因引起,如缺氧、饥饿、钙离子平衡失调、自由基侵袭及药物导致非折叠蛋白和错误折叠蛋白在内质网沉积,信号通过内质网膜传入胞核和胞浆,效应蛋白上调编码GRP78和GRP94等内质网伴侣蛋白基因转录,并广泛减少蛋白翻译,以利于内质网蛋白折叠形成,减少非折叠蛋白在内质网沉积和聚集,使细胞能够耐受及生存,这一针对内质网应激的反应称为非折叠蛋白反应（unfolded protein reaction,UPR）。这些刺激引起从内质网到胞浆和胞核的信号传导,最终导致对存活的适应或凋亡。内质网应激最初对细胞起到保护作用,当外界刺激持续存在时则应激过度增强,则导致细胞凋亡。内质网应激的标志性蛋白是糖调节蛋白GRP78,当应激过度时可特异性激活内质网特异性蛋白激酶,跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶IRE1—α,肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）,后者能够通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase12途径,c-JUN氨酸末端激酶JNK途径,生长停滞及DNA损伤基因（gene for growth arrest and DNAdamage,CHOP/GADD153）途径引起细胞程序性死亡。有关内质网应激在糖尿病心肌病发病机制中的作用国内外尚无相关报道,明确两者关系,在糖尿病心肌病的防治中将起到重要作用。目的1.构建DCM动物模型。2.探讨DCM动物模型心脏重构及心功能改变情况。3.明确内质网应激相关因子在DCM大鼠心肌内表达情况。方法1.DCM动物模型构建雄性Wistar大鼠30只,随机分为2组:对照组10只,DCM组20只。标准大鼠饲料喂养1周后,禁食12h,DCM组大鼠给以腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）65mg/kg,对照组大鼠注射等量柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液。糖尿病大鼠成模的诊断标准为:连续2次空腹血糖≥16.7mmol/L。未达成模标准者剔除。DCM组大鼠血糖升高后,继续喂养5个月,处死取材。2.超声心动图检测分别于糖尿病建模前、实验末进行常规超声心动图检查,测定如下指标:M型超声心动图测定左室收缩末内径（LVIDs）、左室舒张末内径（LVIDd）、射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）;彩色多普勒超声心动图观察瓣膜返流情况;脉冲及连续多普勒超声心动图测定二尖瓣E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波减速时间（EDT）、等容舒张时间（IVRT）、主动脉血流最大速度（APV）。3.心肌组织病理学检查及Masson三色染色动物处死后,进行组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片,常规HE染色,观察心肌细胞形态并拍片;行Masson三色染色,观察胶原分布形态并定量分析心肌组织胶原含量。4.TUNEL染色发鉴定凋亡细胞取组织切片,进行TUNEL染色,观察细胞凋亡水平。5.实时定量RT-PCR法检测分别从左室组织提取总RNA,经逆转录反应（RT）得到cDNA,以GAPDH作为参照,通过real-time PCR技术检测GRP78、Caspase12、CHOP的表达。6.免疫组织化学检测取组织切片,进行GRP78免疫组织化学检测,所用一抗为GRP78多克隆抗体（SantaCruz公司,1:400稀释）。7.免疫印迹检测取左室组织,提取总蛋白,经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印记、ECL显色等步骤,检测GRP78、Caspase12、p-JNK的蛋白表达。结果1.实验动物基本情况及血糖检测实验过程中,对照组大鼠精神状态良好,体重增加明显,反应敏捷,毛色白而光泽。DCM组大鼠出现多食、多饮、多尿和消瘦等症状,体重增加迟缓,精神萎靡,皮毛无光泽,部分出现烂尾、白内障等。整个实验过程中2只大鼠死亡,均为DCM组,死亡原因可能与糖尿病酮症酸中毒、感染或其他相关并发症有关。另有1只大鼠血糖未达成模标准,予以剔除。最终共27只完成实验,其中对照组10只,DCM组17只。注射STZ之前,对照组与DCM组血糖无明显差异（P＞0.05）。注射STZ 1周后,DCM组血糖明显高于对照组（P＜0.01）,并持续至实验末。2.超声心动图检测实验初,对照组及DCM组大鼠超声心动图检测各项指标（包括LVIDs、LVIDd、EF、FS、瓣膜返流、E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、EAT、EDT）无显著性差异。实验末,DCM组大鼠LVIDs及LVIDd明显增加,房室瓣瓣膜返流发生率明显增加,E波最大速度下降,A波最大速度增快,E/A比值下降,FS降低,APV降低,EDT无显著性差异。3.心肌组织病理学检查及Masson三色染色HE染色切片上,对照组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀;DCM组心肌细胞排列紊乱,细胞核大小不甚规则。Masson三色染色:心肌细胞染色呈红色,间质胶原呈蓝绿色,红细胞呈橘黄色。对照组心肌胶原组织分布均匀,DCM组心肌横切面可见心肌内胶原组织明显增多,粗大胶原纤维相互连接成网状,排列紊乱,分布不匀,紧密围绕于心肌细胞周围及小血管周围。定量分析显示,左室心肌组织胶原含量在DCM组明显高于对照组（P＜0.01）。4.TUNEL染色法与对照组相比,糖尿病组大鼠心肌细胞凋亡明显增加（P＜0.05）。5.实时定量RT-PCR法检测与对照组相比,DCM组左室GRP78、CHOP及Caspase12的mRNA表达均明显增高（P＜0.05）。6.免疫组织化学检测GRP78:对照组心肌组织内可见少量、分布均匀、稀疏的浅棕色颗粒,主要定位于心肌细胞及内皮细胞;DCM组心肌细胞胞浆内可见浓密的深棕色颗粒,同时内皮细胞亦见明显表达。7.免疫印迹检测与对照组相比,DCM组左室组织蛋白GRP78、CHOP、Caspase12及p-JNK表达均明显增高（P＜0.05）。结论1.通过腹腔注射STZ并喂养5个月,成功建立了糖尿病性心肌病大鼠模型,为DCM发病机制的研究提供了可靠的平台;2.心肌细胞凋亡增加、胶原组织沉积、心肌纤维化是DCM时的主要组织病理改变;3.心脏舒张功能异常是DCM时的主要功能改变;4.DCM大鼠心肌组织GRP78、CHOP、Caspase12及p-JNK表达增高,提示内质网应激导致的心肌细胞凋亡在DCM的发生发展中发挥重要作用。第二部分高同型半胱氨酸血症通过内质网应激途径诱导心肌细胞凋亡的实验研究背景同型半胱氨酸（homocysteinemia,Hcy）是一种具有毒性的非蛋白类含硫氨基酸,它在体内通过转硫作用和去甲基作用被代谢。5-7%的人群中存在高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia,HHcy）。目前的证据表明HHcy是多种疾病独立危险因素,这些疾病包括:动脉硬化,糖尿病,脂肪肝,以及神经退行性变如帕金森综合症等。有关Hcy能够引起内质网应激的学说目前越来越受到关注。内质网的生理功能包括蛋白质的合成、折叠和释放以及钙的贮存和调节,当内质网内错误折叠蛋白增多以至堆积时就会导致内质网应激,其中一个步骤就包括非折叠蛋白反应,后者是通过GRP78激活后续的信号通路最终引起细胞程序性死亡。Hcy能够破坏蛋白在内质网内双硫键的合成,造成蛋白的错误折叠,从而引起内质网应激反应。研究表明Hcy能够引起多种内质网应激特异性的基因的表达,如GRP78,GRP94等,但是Hcy引起内质网应激在细胞内的靶点以及相关基因的表达目前尚未清楚。尽管HHcy已被认为是心血管疾病的独立危险因素,并且HHcy与糖尿病心肌病的关系已得到证实,但多数研究集中关注在HHcy对内皮细胞和平滑肌的作用上,有关HHcy与糖尿病心肌病中心肌细胞凋亡之间的关系尚无相关报道,而细胞凋亡在糖尿病心肌病的发生发展中起到至关重要的作用。我们前一部分的研究发现,在糖尿病大鼠的心肌内,有关内质网应激的相关因子如GRP78,Caspase12,p-JNK,CHOP均较正常大鼠表达升高,提示内质网应激是导致糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的机制之一;此外,我们对大鼠进行体内Hcy的检测发现,随着糖尿病病程的进展,大鼠体内总Hcy呈现出先降低后升高的趋势,最终出现HHcy。因此我们拟在本研究中,进行体外心肌细胞培养,以观察HHcy对心肌细胞凋亡的影响,及与内质网应激的关系。目的1.观察同型半胱氨酸刺激是否能够加速培养的心肌细胞凋亡。2.观察内质网应激途径是否参与同型半胱氨酸诱导的心肌细胞凋亡过程。方法1.心肌细胞的分离与培养无菌条件下取出Wistar乳鼠的心脏,剪碎,胰酶消化,差速贴壁去除成纤维细胞。生长至融合状态,见明显的心肌搏动,1:1传代,采用2-3代心肌细胞进行实验。2.实验设计1)培养的心肌细胞分别加入不同浓度的同型半胱氨酸（0.025、0.1、1mM）刺激,后进行TUNEL染色判断心肌细胞凋亡情况。并甄选出最佳同型半胱氨酸刺激浓度。2)将培养的心肌细胞给予同型半胱氨酸刺激后收集,分别测定GRP78,Caspase12,CHOP及p-JNK的表达水平。3.TUNEL法测定心肌细胞的凋亡水平将培养的心肌细胞固定,后进行TUNEL染色,测定心肌细胞的凋亡水平。3.实时定量RT-PCR检测GRP78,Caspase12及CHOP的mRNA表达将所收集的细胞提取总RNA,经逆转录反应得到cDNA,以GAPDH作为参照,通过RT-PCR技术检测GRP78,Caspase12及CHOP的mRNA表达.5.Western blot检测GRP78,Caspase12,CHOP及p-JNK的蛋白表达将所收集的细胞提取总蛋白,经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印记、荧光显色等步骤,检测GRP78,Caspase12,CHOP及p-JNK的蛋白表达情况。结果1.同型半胱氨酸对培养心肌细胞凋亡水平的影响TUNEL染色显示,与正常组对照,经过同型半胱氨酸刺激的心肌细胞的凋亡水平明显增高,并且呈浓度和时间依赖型。2.同型半胱氨酸与内质网应激的关系通过蛋白和基因水平的检测,与正常组对照,HHcy组心肌细胞内质网应激的标志性因子GRP78,Caspase12,CHOP及p-JNK均表达增高（P＜0.05）。结论1.HHcy能够引起培养的心肌细胞凋亡增加,从而在糖尿病心肌病的发生发展过程中发挥作用。2.同型半胱氨酸可能通过内质网应激途径诱导心肌细胞凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 内质网应激与糖尿病心肌病心肌细胞凋亡关系的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 高同型半胱氨酸血症通过内质网应激途径诱导心肌细胞凋亡的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表的文章
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 外文论文