论文摘要
第一章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的建立及体外表达目的骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）易于分离扩增,具备多方向分化潜能,免疫源性低,可自体移植,并且有良好迁移性,暗示其在基因治疗中可能成为有价值的运载细胞。本章利用非病毒载体介导脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）转染MSCs,观察细胞转染特性和体外表达情况,建立基因工程细胞,为进一步体内研究提供基因工程细胞来源。方法取豚鼠的骨髓进行MSCs的分离、培养和流式细胞仪鉴定。通过比较两种非病毒载体转染方法（脂质体法和电穿孔法）,选择较好的方法介导pcDNA3.1（-）-BDNF转染MSCs并经优化浓度的G418筛选建立基因工程细胞,转染后48小时（瞬时表达）和筛选后（稳定表达）用免疫组化检测BDNF基因表达情况,RT-PCR进一步验证目的基因表达情况。结果成功培养MSCs,流式细胞鉴定显示各细胞表面标志表达率分别为CD44:94.65%、CD34:4.37%、CD45:7.81%。免疫组化显示脂质体介导转染的BDNF瞬时表达率约为5.80%,电穿孔法瞬时表达阳性率约为24.29%。脂质体法转染筛选14天后细胞几乎全部死亡;电穿孔法转染成功扩大培养并建立工程细胞（BDNF-MSCs）,免疫组化显示BDNF阳性表达率达90%,RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带。结论用电穿孔法成功建立BDNF基因修饰MSCs的工程细胞,并用免疫组化和RT-PCR方法证实了工程细胞具备体外表达目的基因功能。第二章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞正常豚鼠内耳移植的实验研究目的BDNF基因修饰MSCs（BDNF-MSCs）是治疗神经退变性疾病包括感音神经性聋的潜在有效方法,但首先要明确以下三个问题:一是手术及细胞移植对耳蜗功能及结构是否造成不良影响;二是基因修饰的MSCs在耳蜗内存活和分布情况如何;最后是移植细胞在耳蜗内是否能较长时间维持表达目的基因的能力。目前还没有转基因MSCs内耳移植的报道,在此部分我们将在正常豚鼠耳蜗中对这些问题进行初步的探讨。方法正常豚鼠分3组,组Ⅰ:为空白对照组,组Ⅱ:经鼓阶开窗注射MSCs,组Ⅲ:经鼓阶开窗注射BDNF-MSCs。移植细胞均经DAPI荧光标记。3个组的动物均在术前1d、术后7d及术后28d分别行ABR检测,比较各组术前、术后的ABR阈值变化;分别取术后7d及28d各组动物的耳蜗石蜡切片HE染色观察耳蜗结构;荧光显微镜观察移植细胞存活及分布;免疫组化方法检测BDNF在耳蜗内的表达情况。结果经鼓阶开窗移植细胞导致术后7d时ABR阈值的暂时性提高,术后28d后恢复至正常水平。耳蜗石蜡切片HE染色显示实验动物耳蜗内结构无明显异常改变。组Ⅱ和组Ⅲ术后7d耳蜗切片可见荧光信号多分布于耳蜗底周的外淋巴腔（鼓阶和前庭阶）,极少量细胞能迁移到中阶及蜗轴,术后28d移植细胞存活数量有所下降,但两组动物的移植细胞存活时间均超过28d,并且BDNF基因修饰MSCs能提高移植细胞术后28d时的存活率。免疫组化显示组Ⅲ部分移植细胞表达BDNF,术后28d的阳性表达率比术后7d有显著性下降,而其余两组无阳性染色。结论经鼓阶开窗移植MSCs对听力的损害是轻微（<10dB SPL）和暂时的（<28d）。移植后光镜下耳蜗形态结构没有明显变化。移植细胞能存活并分布于耳蜗内各周,主要在耳蜗底周的外淋巴腔,BDNF基因转染MSCs后可以提高移植细胞的存活率。基因修饰的MSCs能在正常耳蜗内维持表达BDNF至少28d,暗示了MSCs可用作细胞载体向内耳输送BDNF治疗感音神经性聋。第三章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞在致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经元的保护作用目的多种因素包括神经营养因子减少、噪音、缺血、耳毒性药物等均会导致内耳毛细胞和螺旋神经元（spiral ganglion neurons,SGNs）的直接或间接的死亡,细胞死亡主要以凋亡的形式。在前面已证明BDNF基因修饰MSCs具备体外及正常耳蜗内表达BDNF的能力,并可以在内耳中存活至少28d,本章中将进一步分析工程细胞在药物致聋豚鼠内耳的表达水平（荧光定量RT-PCR）及对SGNs的保护作用。方法阿米卡星致聋的豚鼠随机分两组。实验组经鼓阶开窗注射BDNF-MSCs,对照组注射外淋巴液。每组均在7d及28d处死动物。荧光定量RT-PCR检测两组动物不同时间点的耳蜗组织BDNF的表达差异,并取耳蜗组织切片行TUNEL检测SGNs凋亡。结果实验组在术后7d和28d的BDNF表达量均显著性高于对照组,实验组术后7d的BDNF表达量是对照组的107倍,术后28d下降为33倍。实验组术后7d及28d的耳蜗SGNs凋亡指数均比对照组有显著性下降。结论药物致聋豚鼠内耳移植的BDNF基因工程细胞能维持表达长达28d,并能显著减少SGNs的凋亡。
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- [1].基因修饰猪技术的应用与展望[J]. 核农学报 2013(11)
- [2].MiR-29b inhibitor基因修饰的骨髓间充质干细胞分化潜能的实验研究[J]. 系统医学 2019(08)
- [3].基因修饰猪在异种器官移植中的研究进展[J]. 中华移植杂志(电子版) 2017(02)
- [4].血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植于放射治疗后组织的实验研究[J]. 国际口腔医学杂志 2014(02)
- [5].基因修饰小鼠饲养管理及使用过程中问题探讨[J]. 中国比较医学杂志 2014(07)
- [6].基因修饰中国猕猴技术的研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展 2014(11)
- [7].基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病的实验研究[J]. 华中科技大学学报(医学版) 2011(04)
- [8].bFGF基因修饰雪旺细胞表达的实验研究[J]. 中国骨与关节损伤杂志 2009(12)
- [9].动物基因修饰的发展动态[J]. 湖北农业科学 2010(10)
- [10].T细胞受体基因修饰在肿瘤免疫细胞治疗中的应用及研究进展[J]. 中国医药生物技术 2016(02)
- [11].基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死的疗效观察[J]. 中国医学创新 2015(21)
- [12].《自然-遗传学》:科学家阐明维C如何精确调控基因修饰[J]. 现代生物医学进展 2014(03)
- [13].基因修饰猪作为人类疾病模型的研究进展[J]. 科技导报 2011(30)
- [14].胶质细胞源性神经营养因子基因修饰神经干细胞移植短暂性脑缺血再灌注损伤大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2009(49)
- [15].脑源性神经营养因子基因修饰脂肪间充质干细胞移植对急性脊髓损伤大鼠运动功能的恢复作用[J]. 湖北医药学院学报 2012(05)
- [16].10项引领未来的得意洋洋技术(一) 基因修饰技术[J]. 科协论坛(上半月) 2009(02)
- [17].肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞[J]. 中外医疗 2012(04)
- [18].脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞治疗坐骨神经损伤[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2009(01)
- [19].基因修饰小鼠应用于心脏研究的进展:从小鼠到人类,从基因到临床[J]. 西安交通大学学报(医学版) 2008(03)
- [20].人表皮生长因子基因修饰细胞在创面修复中作用的研究进展[J]. 中华损伤与修复杂志(电子版) 2014(06)
- [21].皮肤外伤愈合中的基因修饰干细胞疗法[J]. 中国细胞生物学学报 2014(09)
- [22].基因修饰大鼠模型的研究进展[J]. 生命科学 2015(01)
- [23].人胶质细胞源性神经营养因子基因修饰猴雪旺细胞的构建与鉴定[J]. 中国修复重建外科杂志 2013(11)
- [24].双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化(英文)[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(51)
- [25].血管内皮生长因子基因修饰内皮祖细胞对内膜损伤血管修复的影响[J]. 第三军医大学学报 2008(05)
- [26].基因修饰T细胞肿瘤过继免疫治疗安全性的研究进展[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志 2017(04)
- [27].上海生科院在胚系细胞特异性的CRISPR-Cas9基因修饰系统研究中获进展[J]. 江西饲料 2015(05)
- [28].白细胞介素-10基因修饰对骨髓间充质干细胞体外免疫效应的影响[J]. 重庆医科大学学报 2013(11)
- [29].肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗兔股骨头坏死(英文)[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2009(28)
- [30].自然人VS基因修饰人?[J]. 中国新闻周刊 2008(03)
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