应用固化酶检测蔬菜中农药残留的速测技术研究

论文摘要

农药残留的快速检测技术对保护广大消费者身体健康、避免急性食物中毒事件的发生，具有重要意义。本文针对以往农药残留快速检测技术中存在的一些问题进行了比较深入的探讨，在此基础上开发出一套农药残留快速检测设备，并应用于实际蔬菜样品的检测。首先，本文对以往大多数农药残留快速检测技术中使用的快速提取方法进行了研究。在以前的方法中主要通过使用磷酸缓冲液或甲醇水溶液对蔬菜样品进行简单的表面漂洗，以实现对农药残留的提取。作者通过向蔬菜表面添加不同浓度的农药标准样品，分别采用磷酸缓冲液和甲醇水溶液进行农药残留的表面提取，并采用气相色谱进行测定，最终确定了表面漂洗法对敌敌畏、甲胺磷、呋喃丹、乐果、抗蚜威、甲基对硫磷6种农药的提取效率。结果表明，表面漂洗法的提取效率受添加完毕后在室温下放置时间长短的影响。当放置2h时，表面漂洗法对6种农药的提取效率可达到80％以上，但是当放置时间延长到4～5h以后，对6种农药的提取效率急剧下降，一般在20％～40％之间。作者经过实验研究，提出一种采用微型组织捣碎机的快速提取方法，使用这种方法可使6种农药的提取效率达到70％以上。其次，本文对乙酰胆碱酯酶的固定化技术进行了研究。采用交联法对酶进行固定是一种广泛采用的固定化方法，本文对影响固化乙酰胆碱酯酶活性的固定化条件，诸如pH值、BSA、GA、明胶的最佳使用浓度进行了实验研究。经交联法固定的乙酰胆碱酯酶，在室温下放置6个月以后酶活性仍可保持60％以上。但是采用交联法对酶进行固定化过程中必须使用双功能试剂戊二醛，此试剂本身会对乙酰胆碱酯酶的活性造成较大伤害，所以经固定化以后酶的活力回收率较低。目前，一种光交联试剂聚乙烯醇苯乙烯吡啶（PVA-SbQ）在酶的固定化过程中倍受青睐，本文在实验室合成出PVA-SbQ。经PVA-SbQ固定后的乙酰胆碱酯酶具有较高的活性回收率，而且在室温下放置6个月后，固化乙酰胆碱酯酶的活性仍可保持初始固化酶活性的70％以上。第三，为了提高对农药残留检测结果判断的准确性，本研究采用酶标仪对检测结果进行读数测量，以代替目视观察结果的方法。酶标仪通常是针对酶联

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Abstract

第一章概述

第一节我国农药污染现状研究

1.1.1 有机氯农药污染现状研究

1.1.2 有机磷和氨基甲酸酯类农药污染现状研究

第二节农药残留检测技术研究进展

1.2.1 样品的前处理技术

1.2.2 农药残留的仪器检测方法

1.2.3 农药残留的生物检测技术

第三节本论文的主要研究内容

第二章农药残留的快速提取技术研究

第一节试验设备与材料

2.1.1 仪器设备

2.1.2 试剂和材料

第二节漂洗法对残留农药的提取效率研究

2.2.1 几种有代表性漂洗提取法简介

2.2.2 漂洗法对残留农药提取效率的验证研究

第三节快速捣碎法提取效率研究

2.3.1 蔬菜中农药残留的提取

2.3.2 残留农药的萃取回收率试验

第四节实测样品提取过程设计

2.4.1 提取过程设计

2.4.2 残留农药提取效率估算

第五节本章小节

第三章乙酰胆碱酯酶的固定化技术研究

第一节酶的固定化方法简介

3.1.1 吸附法

3.1.2 凝胶或聚合物包埋法

3.1.3 交联法

3.1.4 共价键法

3.1.5 电聚合法

3.1.6 光聚合物交联法

第二节仪器设备与试剂

3.2.1 化学试剂

3.2.2 MV-Ⅳ型酶标仪简介

第三节固化ACHE活性测定方法

3.3.1 固化AchE活性表征原理

3.3.2 固化AchE活性的表征

第四节影响固定化乙酰胆碱酯酶活性的因素

3.4.1 GA浓度对固化乙酰胆碱酯酶活性的影响

3.4.2 BSA浓度对固化乙酰胆碱酯酶活性的影响

3.4.3 明胶浓度对固化乙酰胆碱酯酶活性的影响

3.4.4 pH值对固化乙酰胆碱酯酶活性的影响

3.4.5 固定液中添加AchE量对固化酶活性影响

第五节乙酰胆碱酯酶固定化程序

第六节固化乙酰胆碱酯酶的稳定性研究

第七节聚乙烯醇苯乙烯吡啶对ACHE的固定

3.7.1 PVA-SbQ的合成原理

3.7.2 PVA-SbQ对酶的固定化原理

3.7.3 PVA-SbQ的合成技术路线

3.7.4 PVA-SbQ对乙酰胆碱酯酶的固定

第八节本章小节

第四章乙酰胆碱酯酶的纯化

第一节胆碱酯酶的主要来源

第二节酶活力测定原理及酶活力单位定义

4.2.1 化学试剂及设备

4.2.2 酶活力的测定原理

4.2.3 酶活力单位的定义

第三节乙酰胆碱酯酶活力的测定方法

4.3.1 试剂的配制

4.3.2 检测过程中各参数的确定

4.3.3 乙酰胆碱酯酶活性的测定步骤

第四节比活力测定方法

4.4.1 蛋白含量的测定

4.4.2 比活力的测定

第五节酶的常用分离纯化方法简介

4.5.1 沉淀分离

4.5.2 离心分离

4.5.3 层析分离

4.5.4 电泳分离

第六节乙酰胆碱酯酶的分离纯化

4.6.1 化学试剂及设备

4.6.2 盐析沉淀

4.6.3 层析分离

4.6.4 离子交换层析分离

第七节乙酰胆碱酯酶的纯度鉴定

4.7.1 试剂及设备

4.7.2 制作胶室

4.7.3 制备分离胶

4.7.4 制备浓缩胶

4.7.5 加样和电泳

4.7.6 剥胶

4.7.7 染色和脱色

4.7.8 结果记录

4.7.9 实验结果

第八节本章小结

第五章速测法与气相色谱对比试验

第一节农药残留的检测程序

5.1.1 检测前的准备工作

5.1.2 农药残留的提取

5.1.3 农药残留的检测

第二节方法检测灵敏度的确定

第三节速测法与气相色谱法的比对试验

5.3.1 气相色谱测定方法及测定条件

5.3.2 气相色谱检测结果

第四节本章小结

第六章结论

致谢

参考文献

附录A 粮食、水果和蔬菜中有机磷农药的气相色谱法

附录B 实验中所用部分设备图片

简历及在学期间发表的论文与研究成果

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