莱氏野村菌的发酵工艺与田间应用潜力评测

论文摘要

莱氏野村菌（Nomuraea rileyi （Farlow） Samson）是一种重要的昆虫病原真菌，国内外在该菌的生物学、流行病学等研究领域有较多的研究，但在国内至今尚无商品制剂注册。本研究在前人的研究基础上，对莱氏野村菌菌株的发酵工艺进行了进一步的研究，包括莱氏野村菌液体培养的形态学观察、固体培养基的优化与发酵工艺研究等；同时通过众多菌株的室内毒力测定，筛选出对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、甜菜夜蛾（Spodoptera exgua）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）等3种夜蛾科害虫具有高毒力的菌株，并对高毒力菌株的田间应用技术及效果进行了研究与田间评测。莱氏野村菌的固体发酵工艺是该菌培养及工业化生产中的瓶颈问题。本研究从莱氏野村菌培养基配方入手，优化培养基配方，以获得更高的发酵效率。研究中用单因子筛选法从面粉、大米、黄豆粉、棉子粉、燕麦粉等几种农产品中筛选出莱氏野村菌菌株固体发酵的最佳基质。同时，通过在基本培养基质中加入不同的黄粉虫粉、酵母粉、蛋白胨等氮源，比较孢子得率，从中筛选出能促进莱氏野村菌生长、产孢的最佳氮源。另外，通过在筛选出的培养基质中加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖等不同的碳源，比较孢子利率，确定最佳碳源。实验结果显示：在棉籽粉中加入2%的酵母粉和3%乳糖可以作为莱氏野村菌较适宜固体发酵培养基，产孢量可达3.32±0.38×108/cm2。本文对莱氏野村菌的浅盘固体发酵工艺及薄层发酵工艺进行了研究。浅盘固体发酵工艺研究中，对基本培养基大米和碎大豆的发酵效率进行了比较。在基本培养基按25%接种量接种培养3d的莱氏野村菌SMY培养液，搅拌均匀后，铺浅盘进行固体发酵，料厚1cm，然后置于25±1℃下光照培养，培养10d，以使其充分产孢。产孢量测定结果为：以大米为培养基的产孢量为0.4±0.22×108孢子/g，而以碎大豆为培养基的产孢量则达到6±1.83×108孢子/g。在薄层发酵工艺中，以6%的棉籽粉、2%酵母粉、1.5%琼脂为配方制备培养基，高温灭菌手喷涂到塑料平板托盘上，待其冷却凝固后，喷雾接种莱氏野村菌孢子悬浮液。为避免培养基在发酵过程中的水份蒸发，将接种后的托盘用保鲜膜密封后，置于25±1℃下光照培养。薄层发酵工艺在第10d的产孢量可达2.45±0.16×108孢子/cm2，且此时薄层喷涂的培养基中已利用充分，极易干燥及收孢。高毒力莱氏野村菌菌株的筛选是进行后继应用研究及产品开发的基础。本文在前期粗筛的基础上，确定了Nr03、Nr06、Nr09、Nr11和Nr15等5株莱氏野村菌为进一步研究对象。用喷雾法对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫等3种夜蛾科害虫进行进一步的室内毒力测定。在孢子悬浮液浓度分别为1×105、1×106、1×107孢子/mL2，喷雾塔雾化接种时单位面积的孢子附着量为188.9～4048.3孢子/mm2。时间-剂量-死亡率模型分析显示：5株莱氏野村菌菌株Nr03、Nr06、Nr09、Nr11、Nr15在188.9～4048.3孢子/mm2接种量范围时，斜纹夜蛾第10d时的死亡率为60%～95%，其中菌株Nr15对斜纹夜蛾的毒力水平最高，第10d时的侵染率达到95%。Nr15菌株对斜纹夜蛾的半致死浓度(LC50)为266.7孢子/mm2，而在4048.3孢子/mm2浓度下的半致死时间(LT50)为5.81d。供试的5株莱氏野村菌菌株对棉铃虫与甜菜夜蛾的致病力相对较弱，侵染率均不足50%。试验结果表明，莱氏野村菌菌株对夜蛾科害虫体现出明显的寄主专化性，对高毒力菌株呈献明显的量效关系。本研究中筛选出了高毒力的Nr15菌株，可用于斜纹夜蛾生物防治的后继研究。莱氏野村菌Nr15菌株的田间试验设置了1×108、1×107孢子/ml两个处理浓度及1个空白对照。用超低量喷雾的方法防治白菜上的斜纹夜蛾。每天观察记录各小区每棵植株上的僵虫数，直至老熟幼虫开始化蛹为止。处理前后斜纹夜蛾死亡率（%）和较正死亡率（%）的计算结果显示，在田间处理后第13d，处理浓度为1×107孢子/ml的处理区，死亡率（%）和较正死亡率（%）分别为96.56±5.12%和96.36±5.68%；而1×108孢子/ml处理区的死亡率（%）和较正死亡率（%）分别为96.3±2.6%和96.09±3.01%，两种浓度处理间在死亡率的差别上不明显，均取得了非常显著的田间防治效果。莱氏野村菌Nr15菌株具有巨大的真菌杀虫剂开发潜力及广阔的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.2 莱氏野村菌的研究与应用现状
• 1.2.1 莱氏野村菌的生物学特性
• 1.2.2 莱氏野村发酵生产的研究现状
• 1.2.3 莱氏野村菌的致病性研究
• 1.2.4 莱氏野村菌的应用
• 1.3 总结与展望
• 2 莱氏野村菌液体发酵工艺的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 供试菌株
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 分生孢子悬浮液的制备
• 2.2.4 莱氏野村菌在 SMY 培养液中的生长状况观察
• 2.2.5 低温刺激对液体培养莱氏野村菌形态及产孢子类型的影响
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 NrO3、NrO9 在液体培养中的形态观察
• 2.3.2 低温刺激对液体培养莱氏野村菌形态及产孢子类型的观察
• 3 莱氏野村菌固体发酵工艺的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 供试菌株
• 3.2.2 莱氏野村菌在几种农产品培养基的产孢量测定
• 3.2.3 在培养基中加入不同氮源对莱氏野村菌产孢量的影响
• 3.2.4 在培养基中加入不同碳源对莱氏野村菌产孢量的影响
• 3.2.5 莱氏野村菌固体培养工艺的初步研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 莱氏野村菌在 5 种农产品培养基的产孢量的测定结果
• 3.3.2 在培养基中加入不同氮源对莱氏野村菌产孢量的影响
• 3.3.3 在棉籽粉 6%+酵母粉 2%中加入 5 种碳源对莱氏野村菌产孢量影响
• 3.3.4 莱氏野村菌固体浅盘培养与薄层涂布培养的测定结果
• 4 莱氏野村菌对几种夜蛾科害虫的室内毒力测定
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 供试菌株
• 4.2.2 孢子粉的制备
• 4.2.3 供试昆虫
• 4.2.4 生物测定
• 4.2.5 数据分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 孢子分布与剂量
• 4.3.2 不同菌株的致病力分析
• 4.3.3 时间-剂量-死亡模型
• 5 莱氏野村菌田间应用初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 供试生防药剂
• 5.2.2 供试作物
• 5.2.3 防治对象
• 5.2.4 试验方法
• 5.2.4.1 试验设计
• 5.2.4.2 试验田基本状况
• 5.2.4.3 试验处理方法
• 5.2.4.4 田间药效的调查
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 田间试验期间天气情况
• 5.3.2 白菜不同部位孢子附着量的测定结果
• 5.3.3 莱氏野村菌 Nr15 菌株对斜纹夜蛾的田间防治效果
• 6 结论与讨论
• 6.1 莱氏野村菌液体发酵的研究
• 6.2 莱氏野村菌固体发酵工艺的研究
• 6.3 莱氏野村菌毒力菌株的选择
• 6.4 莱氏野村菌田间应用的研究
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间投稿的学术论文