论文摘要
第一部分HIV-1vpr基因多态性及其进化树的分析目的:分析来自中国各地区的HIV-1感染者的vpr基因序列,HIV-1vpr多态性在人群中的具体分布情况,从分子流行病角度描述vpr基因变异的基本特征,比较中国各地区HIV-1 vpr基因的变异位点的自身特点以及与国外以往研究的异同。结合感染者的疾病特点及临床资料,挑选出有临床意义的变异,为进一步研究HIV-1 vpr基因变异的功能意义、作用机理及其与感染者临床病情的关系打下基础。方法:提取348例HIV-1感染者血浆病毒RNA,运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及巢式PCR（nested PCR）的方法进行HIV-1 vpr基因的扩增,经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后送公司测序。用Blast、ClustalW、Mega4.0、DNAsp4等相关生物分析软件进行vpr基因核苷酸和Vpr蛋白质序列分析,并构建进化树,分析中国HIV-1感染者的vpr基因的多态性特征、变异特征和亚型的分子流行病学特征。并将感染者的相应临床资料如传播途径、性别、年龄、病毒水平高低、淋巴细胞亚群的升降及临床病程的进展情况与上述结果综合起来,进行对比分析,观察HIV-1 vpr基因不同变异位点可能导致的不同的临床表现。结果:HIV-1vpr基因序列结果分析显示:一、AB型多见于男性双性恋和同性恋感染者;AE和BC亚型主要见于男性感染者,其传播途径主要为异性性传播和静脉吸毒;而B亚型主要见于女性感染者,其中以异性间传播占60.7%;C亚型主要见于男性,其传播途径与AE亚型相似,仍以异性和静脉吸毒为主。各Vpr亚型间患者年龄没有显著区别,主要是以青壮年为主。二、观察到一些HIV-1 Vpr亚型特异性氨基酸位点。比如,R37,N37,H41,V48,T63,Y72只在亚型B/AB中发现,而R3,Q24,G41,V70,G94则在亚型C/BC中发现,而G6,I70,Q86,G89,S89则主要见于AE亚型。观察到Vpr氨基酸序列有9个位点高度变异,变异率大于20%,分别是第8,48,55,63,70,84,85,86,94位。通过对核苷酸分析显示,完全保守的位点有98个约占33.68%,简约信息位点和单一变异位点分别为135和41。三、还观察到HIV-1 Vpr第55、63、70、85、86、89、94位氨基酸的变异可能与感染者临床表现相关,并有待进一步研究。结论:1.发现vpr基因各亚型在传播途径和男女比例方面各有所不同,与资料显示的env基因亚型与传播途径和男女比例的关系大致相似。2.首次发现一些vpr基因亚型特异性的氨基酸位点。3.首次分析了中国感染者的HIV-1vpr基因进化树的特征。4.首次发现中国感染者HIV-1 Vpr氨基酸序列的第55、63、70、85、86、94位等变异可能与感染者的临床表现有关,但没有发现Vpr 77Q和临床表现的明显关系。第二部分重组真核表达载体pcDNA-vpr对细胞凋亡的影响背景和目的:HIV-1病毒蛋白R含有96个氨基酸,在HIV-1,HIV-2,SIV中高度保守。Vpr对AIDS的致病机理极其重要,但在自然感染过程中它的多态性及其确切功能还有待研究。HIV-1Vpr氨基酸序列的变异可能会使病毒复制能力减弱、疾病进展延缓、病毒载量低、发展成免疫缺陷较慢。尽管Vpr蛋白较小,但它在病毒复制过程中具有多种功能:1.影响反转录过程的准确性;2.作为前融合复合体的一个组成部分参与病毒DNA转运至细胞核;3.使感染细胞周期阻滞;4.诱导被感染细胞的凋亡;5.与宿主基因共同反式激活HIV-1LTR。另外,Vpr不仅存在于病毒颗粒和感染细胞中,在AIDS患者的血清和脑脊液也发现了它的游离分子,提示可通过不同的途径发挥它的生物学功能。由于本研究第一部分工作已发现HIV-1Vpr序列某些位点突变或者位点组合变异对感染者的临床过程有所影响,故第二部分工作拟观察Vpr变异株致宿主细胞凋亡作用的影响,以实验研究来探索上述现象的可能机制。本研究旨在观察vpr基因多态性所致的Vpr致细胞凋亡能力的变化。方法:根据第一部分工作,经过统计分析从中挑选出具有中国人HIV-1感染者代表性的变异株14株。vpr基因PCR产物经纯化后进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切,以pcDNA3.1（+）真核表达质粒连接转化实验,14株重组的pcDNA3.1-vpr变异株送测序确认重组成功。将重组质粒用脂质体瞬时转染至Hela细胞,同时设立Hela细胞空白对照、空载体空白对照。用含G418的培养基进行筛选,72小时后收获细胞。RT-PCR检测目的基因mRNA水平的表达,荧光显微镜观察Hoeschst凋亡染色细胞;DNA琼脂糖电泳法检测凋亡梯度带,Annexin检测细胞凋亡,Caspace活性检测探讨细胞凋亡的途径。结果:通过对14株vpr基因片段转染Hela细胞后,显示出不同的致凋亡能力。本研究初步发现以下现象:①vpr的AE亚型普遍致凋亡能力较其他亚型为低,85P和94G的变异可能为最主要的影响因素,70V为次要因素。②不含任何一个主要变异点的9号序列（属于B亚型）,显示出非常强的致凋亡能力。这也与第一部分研究中相应变异序列的临床表现比较相符。③HIV-1 vpr致属主细胞凋亡的机理之一可能与Caspase3途径激活有关。结论:1.中国感染者的HIV-1 Vpr的AE亚型致凋亡能力可能较其他亚型为低,85P和94G的变异可能为最主要的影响因素,70V为次要因素。2.不含任何一个主要变异点的9号序列（属于B亚型）,显示出非常强的致凋亡能力。3.HIV-1vpr致被感染细胞凋亡的机理之一可能与Caspase3途径激活有关。
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