利普司他汀菌种选育及其发酵工艺的优化

论文摘要

为了开发一种毒、副作用小,作用机制独特的新型高效减肥药物,国内外科研机构和制药企业做了很多工作,我们采用发酵法生产这类药物之一——利普司他汀。利普司他汀是毒三素链霉菌发酵生产的一种抑制胰脂肪酶的次级代谢产物。根据利普司他汀的生物合成途径和代谢机理,对利普司他汀产生菌毒三素链霉菌进行推理选育,旨在获得高单位菌株。以毒三素链霉菌XC-LP-2为出发菌株,经过3次紫外线诱变处理,分别筛选耐豆油、辛酸钠、亮氨酸的突变株,并结合自然分离纯化,最终获得高产突变株毒三素链霉菌XC-LP-7-69,其摇瓶效价达831μg/mL。较出发菌株（310μg/mL）生产能力提高了168%。传代试验表明,该菌株的高产性能遗传特性较稳定。用正交试验法优化了利普司他汀的发酵培养基,XC-LP-7-69的摇瓶发酵单位提高了21.5%。从利普司他汀的摇瓶发酵着手,考察了无机盐、温度、种龄、接种量、溶氧、剪切力、补料对利普司他汀生物合成的影响。结果表明:KH2PO4和（NH4）2SO4的最宜加量分别为0.1%和0.15%;其最佳培养温度为27℃;采用优化的发酵配方和发酵条件,并进行中间补料,可大幅度提高发酵效价,其摇瓶效价达1400μg/mL。以摇瓶发酵实验为基础,进行了利普司他汀发酵由摇瓶到15L发酵罐的放大,罐上发酵效价1561μg/mL。

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第一章文献综述

引言

1.1 微生物来源的胰脂肪酶抑制剂研究发展

1.1.1 微生物来源的胰脂肪酶抑制剂

1.1.2 胰脂肪酶抑制剂的作用机制

1.1.3 Lipstatin生物合成的研究

1.2 减肥药物的研究现状及进展

1.2.1 食欲抑制剂

1.2.2 产热剂

1.2.3 消化吸收阻滞剂

1.2.4 激素调节剂

1.3 本课题的立题意义

1.4 本课题的主要研究内容

第二章 Lipstatin高产菌种的理论性筛选

2.1 材料与方法

2.1.1 出发菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 培养条件

2.1.4 测定方法

2.1.5 菌种的诱变处理

2.1.6 豆油耐性菌株的筛选

2.1.7 亮氨酸耐性菌株的筛选

2.1.8 辛酸盐耐受性菌株的筛选

2.1.9 高产菌株传代稳定性试验

2.1.10 仪器设备

2.2 结果与讨论

2.2.1 紫外线诱变对XC-L-2的致死率

2.2.2 豆油耐性突变株的筛选

2.2.2.1 菌体XC-LP-2对豆油的耐受性考察

2.2.2.2 豆油耐受性突变株的筛选

2.2.3 耐亮氨酸突变株的筛选

2.2.4 辛酸钠耐性突变株的筛选

2.2.4.1 菌株XC-LP-5-23对辛酸钠的耐受性考察

2.2.4.2 辛酸钠耐性菌株的选育

2.2.5 菌株XC-LP-7-69的传代稳定性

2.2.6 突变株XC-LP-7-69与原始出发菌株XC-LP-2形态，生化特性比较

2.2.6.1 突变株XC-LP-7-69与原始出发菌株XC-LP-2的菌落形态差异

2.2.6.2 突变株XC-LP-7-69与出发菌株XC-LP-2摇瓶发酵培养时的生化特性比较

2.3 小结

第三章利普司他汀发酵工艺的研究

3.1 材料与方法

3.1.1 菌种

3.1.2 培养基

3.1.3 培养条件

3.1.4 分析方法

3.1.5 发酵工艺优化

3.2 结果与讨论

3.2.1 菌株XC-LP-7-69发酵培养基优化

3.2.2 发酵液的不同初始pH对利普司他汀发酵的影响

3.2.3 无机盐对利普司他汀生物合成的影响

3.2.3.1 不同浓度的磷酸二氢钾对利普司他汀发酵的影响

4）₂SO₄对lipstatin发酵的影响'>3.2.3.2 不同浓度的（NH₄）₂SO₄对lipstatin发酵的影响

3.2.4 温度对利普司他汀发酵的影响

3.2.5 不同种龄的种子对利普司他汀发酵的影响

3.2.6 接种量对利普司他汀发酵的影响

3.2.7 溶氧对利普司他汀生物合成的影响

3.2.7.1 改变摇瓶装量对利普司他汀发酵的影响

3.2.7.2 不同摇床转速对利普司他汀发酵的影响

3.2.8 剪切力对利普司他汀发酵的影响

3.2.9 补料分批发酵试验

3.2.9.1 豆油／甘油加入时间对利普司他汀生物合成影响

3.2.9.2 不同补料量对利普司他汀发酵的影响

3.2.10 补料与不补料工艺比较

3.2.11 利普司他汀的发酵放大

3.2.11.1 不补料分批发酵试验

3.2.11.2 降低发酵培养基中豆油加量，补加部分料液对发酵的影响

3.3 小结

第四章结论

参考文献

致谢

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