利用酵母细胞生物转化法合成天然2-苯乙醇的研究

论文摘要

2-苯乙醇是一种具玫瑰气味的芳香醇,作为香料广泛用于食品、日化和轻工等领域。人们对天然香料消费需求的日益增长,推动了利用生物技术方法生产天然2-苯乙醇的研究。以发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸为前体,利用酵母细胞将其转化为2-苯乙醇,产品具有天然属性,可以取代从玫瑰或其它植物精油中提取的天然2-苯乙醇,具有广阔的开发前景。本文以提高2-苯乙醇转化浓度和生产率为目标,从上、中、下游系统地研究了2-苯乙醇转化合成工艺,大幅度提高了2-苯乙醇的转化浓度和生产率,为生物转化法合成天然2-苯乙醇的工业化应用奠定了良好的基础。从15个酵母菌株中,筛选出1株对2-苯乙醇耐受性强、转化合成2-苯乙醇浓度高的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BD菌株,对其进行纯化并结合紫外诱变,得到酿酒酵母BD18菌株,在未经优化的培养基中,该菌株转化合成2-苯乙醇浓度达到2.04g/L,是1株适用于2-苯乙醇的生物转化合成的理想菌种。采用单因素试验和正交试验,优化了转化合成2-苯乙醇的培养基组成、种子培养基组成和转化培养条件,使得2-苯乙醇浓度有大幅度提高。摇瓶转化合成2-苯乙醇的最佳工艺是:种子培养基组成为葡萄糖40g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出粉10g/L,装量为40mL/250mL三角瓶;转化培养基组成为蔗糖120g/L、酵母浸出粉5g/L、KH2PO47.5g/L、K2HPO49.6g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L,装量为30mL/250mL三角瓶;种子培养基接种后于30℃培养24h,按10%的接种量移种至转化培养基,再加入10g/L的L-苯丙氨酸;转化体系于30℃、200r/min条件下培养18h,2-苯乙醇的浓度可达到4.64g/L,摩尔产率为62.7%,生产率为0.26g/（L·h）。采用Box-Behnken中心组合设计和响应面分析,建立了2-苯乙醇浓度与蔗糖、酵母浸出粉和L-苯丙氨酸之间的二次多项式回归模型,模型具有较高的准确性和实用性,可为生物转化法合成2-苯乙醇的最优化生产提供理论基础。采用油酸萃取,聚丙二醇2000萃取和D101大孔树脂吸附3种产物原位分离法转化合成2-苯乙醇,2-苯乙醇的摩尔产率均有所提高。在油酸与培养基体积比为1:3,振荡转速为250r/min,转化温度为30℃,底物浓度为14g/L的条件下,转化培养18h,油酸和水相中2-苯乙醇的浓度分别达到14.9g/L和1.74g/L,2-苯乙醇的摩尔产率达到64.7%,生产率达到0.37g/（L·h）,较单一水相体系生物转化合成2-苯乙醇的生产率0.26g/（L·h）提高了44.3%。以聚丙二醇2000为萃取溶剂,加入体积与培养基体积比为1:2,底物浓度为12g/L时,转化18h,聚丙二醇中的2-苯乙醇浓度可达11.1g/L,摩尔产率为68.1%,生产率为0.31g/（L·h）。在30mL培养基中加入2g湿大孔树脂D101,底物浓度为12g/L,转化24h,2-苯乙醇总浓度可达6.17g/L,其中3.15g/L保留在培养基中,3.02g/L吸附到D101中,摩尔产率达到69.5%,生产率为0.26g/（L·h）。在5L发酵罐中,进行常规水相体系、有机溶剂萃取法和大孔树脂吸附法转化合成2-苯乙醇的放大实验,取得的结果与摇瓶工艺相近,表明摇瓶转化工艺放大较为容易。基于5L发酵罐生物转化合成2-苯乙醇得到的菌体得率、2-苯乙醇浓度、蔗糖消耗实验数据,建立了转化过程中菌体生长的Logistic模型、2-苯乙醇生成的Luedeking-Piret模型和蔗糖消耗的Luedeking-Piret相似模型。3个动力学模型具有较高的拟合精度,能准确反映2-苯乙醇生物转化过程及其动力学特征,可用于酿酒酵母转化生产2-苯乙醇过程的预测。通过对多种有机溶剂的筛选,得出乙酸乙酯是萃取分离2-苯乙醇的最佳溶剂,其萃取的最佳相比0.5,萃取液经减压蒸馏除去乙酸乙酯,便得到提纯的2-苯乙醇,收率为93.6%,纯度可以达到90.7%。静态吸附实验结果表明大孔树脂D101也是很好的2-苯乙醇分离吸附剂。采用大孔树脂D101柱分离2-苯乙醇中,当转化液中2-苯乙醇浓度为4.5g/L左右时,最佳上样量为5.5柱体积（BV）,上样速度10BV/h。样品上柱后,用上样量同等体积的蒸馏水洗涤树脂,再用3BV的95%乙醇进行洗脱,收集洗脱液,减压蒸馏去除乙醇,此工艺条件下分离得到的2-苯乙醇样品收率为84.4%,纯度为85.2%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 微生物转化
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 微生物转化的特点
• 1.1.3 微生物转化的方法
• 1.2 生物转化与香料香精
• 1.2.1 香料香精概述
• 1.2.2 生物转化与天然香料香精
• 1.3 2-苯乙醇概述
• 1.3.1 2-苯乙醇的理化特征
• 1.3.2 化学法合成2-苯乙醇
• 1.3.3 2-苯乙醇的纯化
• 1.4 生物转化法合成2-苯乙醇
• 1.4.1 生物转化法合成2-苯乙醇的代谢途径
• 1.4.2 生物转化法合成2-苯乙醇的微生物
• 1.4.3 2-苯乙醇对细胞的毒性
• 1.5 本论文研究的意义、目的与内容
• 2 生物转化法合成2-苯乙醇的菌株筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要实验试剂
• 2.2.2 酵母菌株
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 2-苯乙醇的转化合成
• 2.2.5 酵母菌株对2-苯乙醇的耐受性比较试验
• 2.2.6 酵母菌株的紫外诱变与分离
• 2.2.7 2-苯乙醇浓度的测定
• 2.2.8 2-苯乙醇气相色谱-质谱联用（GC-MS）的鉴定
• 2.2.9 酵母细胞生物量的测定
• 2.2.10 2-苯乙醇的摩尔产率计算
• 2.2.11 数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌株初筛
• 2.3.2 菌株复筛
• 2.3.3 酵母菌株对2-苯乙醇的耐受性比较
• 2.3.3.1 液体培养条件下酿酒酵母菌株对2-苯乙醇的耐受性比较
• 2.3.3.2 平板培养条件下酿酒酵母菌株对2-苯乙醇的耐受性比较
• 2.3.4 酿酒酵母BD菌株的诱变与分离
• 2.3.4.1 紫外诱变的致死率曲线
• 2.3.4.2 突变菌株的筛选
• 2.4 本章小结
• 3 生物转化法合成2-苯乙醇的工艺研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 转化菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 2-苯乙醇转化合成
• 3.2.4 2-苯乙醇浓度的测定
• 3.2.5 L-苯丙氨酸浓度的测定
• 3.2.6 酵母细胞生物量的测定
• 3.2.7 残糖浓度的测定
• 3.2.8 响应面试验设计和分析
• 3.2.9 数据处理
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 转化培养基组成的优化
• 3.3.1.1 葡萄糖浓度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.1.2 碳源种类对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.1.3 蔗糖浓度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 4）₂SO₄浓度对转化合成2-苯乙醇的影响'>3.3.1.4（NH₄）₂SO₄浓度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.1.5 酵母浸出粉浓度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.1.6 磷酸钾盐浓度及pH对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.1.7 无机盐浓度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.1.8 底物浓度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.1.9 底物加入方式对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.1.10 转化培养基主要组分的正交优化
• 3.3.2 种子培养基优化
• 3.3.2.1 种子培养基成分浓度的优化
• 3.3.2.2 种子最佳培养时间的确定
• 3.3.3 培养条件对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.3.1 温度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.3.2 培养基装量对转化合成2-苯乙醇的影响
• 3.3.4 培养基主要组分浓度的响应面法优化
• 3.3.4.1 Box-Behnken试验设计
• 3.3.4.2 二次回归模型拟合及方差分析
• 3.3.4.3 响应面分析及最优水平确定
• 3.3.4.4 响应面优化结果验证
• 3.3.5 摇瓶转化合成2-苯乙醇的时间曲线
• 3.4 本章小结
• 4 原位产物分离法生物转化合成2-苯乙醇的工艺研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 转化菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 大孔树脂及其预处理
• 4.2.4 大孔树脂吸附容量、解吸率和吸附率的测定
• 4.2.5 2-苯乙醇的生物转化合成
• 4.2.6 2-苯乙醇和L-苯丙氨酸浓度的测定
• 4.2.7 酵母菌体得率的测定
• 4.2.8 残糖浓度的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 构建有机溶剂萃取转化体系的有机溶剂选择
• 4.3.2 油酸萃取ISPR法生物转化合成2-苯乙醇
• 4.3.2.1 油酸加入体积对转化合成2-苯乙醇的影响
• 4.3.2.2 油酸加入时间对转化合成2-苯乙醇的影响
• 4.3.2.3 振荡转速对转化合成2-苯乙醇的影响
• 4.3.2.4 转化温度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 4.3.2.5 底物浓度对转化合成2-苯乙醇的影响
• 4.3.2.6 油酸萃取生物转化合成2-苯乙醇过程的时间曲线
• 4.3.3 聚丙二醇萃取ISPR法生物转化合成2-苯乙醇
• 4.3.4 大孔树脂吸附ISPR法生物转化合成2-苯乙醇研究
• 4.3.4.1 静态吸附法筛选大孔树脂
• 4.3.4.2 大孔树脂吸附转化合成2-苯乙醇的初步实验
• 4.3.4.3 D101加量对2-苯乙醇合成浓度的影响
• 4.3.4.4 培养基初始pH对树脂吸附转化合成2-苯乙醇的影响
• 4.3.4.5 底物浓度对树脂吸附转化合成2-苯乙醇的影响
• 4.3.4.6 树脂吸附转化合成2-苯乙醇的时间曲线
• 4.4 本章小结
• 5 生物转化法合成2-苯乙醇的发酵罐小试及转化动力学研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 转化菌种
• 5.2.2 发酵罐
• 5.2.3 培养基
• 5.2.4 5L发酵罐中生物转化法合成2-苯乙醇实验
• 5.2.5 分析方法
• 5.2.6 数据处理
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 5L发酵罐中生物转化法合成2-苯乙醇结果
• 5.3.1.1 常规水相体系中转化合成2-苯乙醇
• 5.3.1.2 油酸萃取法生物转化合成2-苯乙醇
• 5.3.1.3 大孔树脂吸附法生物转化合成2-苯乙醇
• 5.3.2 生物转化法合成2-苯乙醇动力学研究
• 5.3.2.1 模型假设
• 5.3.2.2 菌体生长动力学模型
• 5.3.2.3 产物生成动力学模型
• 5.3.2.4 基质消耗动力学模型
• 5.3.2.5 不同方式生物转化合成2-苯乙醇动力学参数的比较
• 5.4 本章小结
• 6 生物转化法合成2-苯乙醇的分离与纯化
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 有机溶剂和大孔树脂
• 6.2.2 供试转化液
• 6.2.3 有机溶剂萃取法分离2-苯乙醇
• 6.2.4 大孔树脂静态吸附2-苯乙醇实验
• 6.2.5 大孔树脂对2-苯乙醇的动态吸附实验
• 6.2.6 分析方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 有机溶剂萃取法分离2-苯乙醇
• 6.3.1.1 萃取溶剂的选择
• 6.3.1.2 萃取相比对2-苯乙醇收率的影响
• 6.3.1.3 乙酸乙酯萃取分离2-苯乙醇样品的纯度
• 6.3.2 大孔树脂吸附法分离2-苯乙醇
• 6.3.2.1 大孔吸附树脂的静态吸附容量和解吸率
• 6.3.2.2 静态吸附时间对2-苯乙醇吸附容量的影响
• 6.3.2.3 转化液pH对静态吸附容量的影响
• 6.3.2.4 D101对2-苯乙醇的吸附等温线
• 6.3.2.5 样品上柱流速对动态吸附容量的影响
• 6.3.2.6 动态吸附2-苯乙醇的流出曲线
• 6.3.2.7 不同乙醇浓度洗脱2-苯乙醇的洗脱曲线
• 6.3.2.8 水洗涤体积对产品收率和纯度的影响
• 6.4 本章小结
• 7 论文总结
• 7.1 论文的研究总结
• 7.2 论文的创新之处
• 7.3 进一步研究的展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的论文和完成的工作