体外培养骨髓源神经干细胞的死亡机制及抗氧化损伤的实验研究

论文摘要

神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的研究一直是神经医学基础研究的热点之一,NSCs移植或促进自体脑内NSCs再生为治疗多种损伤性或退行性中枢神经系统（central nervous system,CNS）疾病提供了一种新的策略,已经成为CNS疾病治疗中引入注目的研究方向。NSCs基础研究和临床应用中,体外培养是最基础和必不可少的阶段,这一阶段NSCs的生长情况以及生物学性状的保持直接影响着体内移植治疗的效用。NSCs移植已经开始应用于一部分病例的临床试验,但如何避免体外传代培养及移植后NSCs的衰退和死亡,维持其长期存活、发育、分化并行使功能依然是一系列复杂而重要的问题。相对于胚胎或成体脑内来源NSCs及永生化神经元,骨髓源性神经干细胞（bone marrow stromal cells-derived neural stem cells,BMSCs-d-NSCs）因其取材容易、来源充足、致瘤风险低、避免伦理争议、可自体移植,更贴近未来临床应用。但因其为非神经组织来源,除一般的取材、分离,更须经体外诱导、分化及调控阶段,复杂的体外条件下更容易发生细胞损伤导致衰退和死亡。故研究BMSCs-d-NSCs衰退和死亡的机制并寻求有效手段维持和促进其长期存活具有重要临床意义。本研究以大鼠BMSCs-D-NSCs作为研究对象,一方面,通过分离、培养大鼠骨髓基质干细胞,促其向NSCs分化,观察其体外培养的生物学特性,了解其不同培养阶段的衰退和死亡（坏死和凋亡）情况;另一方面,通过抗氧化剂EUK-134的抗氧化损伤作用,研究其对大鼠BMSCs-D-NSCs存活的影响,探索细胞分离培养,诱导分化过程中减少其氧化损伤、促进存活的新策略。第一部分体外培养条件下骨髓源性神经干细胞衰退和死亡情况的观察目的动态观察体外培养不同时间段骨髓源性神经干细胞（bone marrowstromal cells-derived neural stem cells,BMSCs-d-NSCs）的衰退和死亡情况,了解其体外培养条件下衰退和死亡的机制与规律。方法以密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,以神经干细胞专用培养基促其向NSCs分化,以AO染色、Rhodamine 123染色、TUNEL法及AnnexinV-EGFP/PI双染荧光显微镜下直接观察、并流式细胞仪检测不同培养阶段细胞凋亡和坏死情况。结果多种检测方法证实,BMSCs-d-NSCs在体外培养条件下7d、14d、21d、4w、8w均会出现不同程度以凋亡为主的衰退和死亡现象,培养4w以上细胞凋亡和坏死情况较3w内明显增多。结论体外培养BMSCs-d-NSCs的衰退和死亡有凋亡和坏死两种机制的共同参与,并随时间延长凋亡和坏死事件逐渐增多,为下一步探索相应的细胞保护研究奠定了实验基础。第二部分EUK-134对骨髓源性神经干细胞抗氧化损伤作用的实验研究目的研究抗氧化剂EUK-134对体外培养条件下骨髓源性神经干细胞（bonemarrow stromal cells-derived neural stem cells,BMSCs-d-NSCs）的抗氧化损伤作用。方法以密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,以神经干细胞专用培养基促其向NSCs分化,以0.5mM、1mM、2mM三种浓度EUK-134添加培养基培养BMSCs-d-NSCs,分别在2w、4w时以Annexin V-EGFP/PI双染流式细胞仪检测,以同一取材的未添加EUK-134常规培养的同期细胞为对照,比较各组细胞凋亡和坏死情况。结果各组细胞传代培养后,各EUK-134处理组较对照组活力更为旺盛,增殖速度快,细胞凋亡和坏死情况减少。经流式细胞仪检测,结果可见培养2w时各组间凋亡细胞和坏死细胞比例均有明显差异;1mM、2mM EUK-134处理组细胞凋亡和坏死比例均明显少于对照组。培养4w时各组凋亡细胞和坏死细胞比例也均有明显差异;各EUK-134处理组细胞凋亡和坏死比例均明显少于对照组,且1mM、2mM处理组细胞凋亡和坏死比例也少于0.5mM处理组。结论抗氧化剂EUK-134可以减少体外培养BMSCs-d-NSCs的凋亡和坏死,特别是以1.0mM、2.0mM EUK-134培养细胞,更具明显的抗氧化损伤作用,能够增强细胞活力,减少细胞的凋亡和坏死事件的发生。小结本课题致力于研究体外培养骨髓源性神经干细胞衰退和死亡的机制并寻求维持和促进其长期存活的有效手段。本实验以体外培养BMSCs-d-NSCs为研究对象,选用四种方法联合检测,分别从细胞形态学、线粒体跨膜电位、生化改变、细胞膜水平、细胞核DNA片断化等不同角度,以及应用相差显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪等多种手段动态观察、验证和区分BMSCs-d-NSCs体外培养过程中衰退死亡情况。结果证实:（一） BMSCs-d-NSCs在体外培养不同阶段的细胞死亡事件中,均有凋亡和坏死两种机制的共同参与,并多以凋亡为主,随时间延长细胞凋亡和坏死情况均逐渐增多,培养4w后较3w内更为明显。（二）抗氧化剂EUK-134可以明显减少体外培养BMSCs-d-NSCs的凋亡和坏死,特别是以1.0mM、2.0mM EUK-134培养细胞,更具明显的抗氧化作用,能够减少细胞氧化应激损伤,增强细胞活力,减少细胞的凋亡和坏死事件的发生,更好地改善其存活。EUK-134的抗氧化策略在神经干细胞体外培养和移植后的细胞保护研究中可能具有广阔应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 研究背景及目的
• 一、研究背景
• 二、研究目的
• 参考文献
• 第一部分 体外培养条件下骨髓源性神经干细胞衰退和死亡情况的观察
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 EUK134对骨髓源性神经干细胞抗氧化损伤作用的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 附图
• 参考文献
• 略词中英文对照表
• 综述
• 攻读学位期间撰写和发表的论文
• 致谢