麦胚抗氧化肽RVF对SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用及其机理研究

论文摘要

氧化应激是引起衰老和神经退行性疾病的主因。正常条件下,人体内拥有一套完整的抗氧化系统以维持自由基的动态平衡,一旦自由基产生过多或由于功能障碍导致抗氧化防御系统清除能力不足时,过剩的氧自由基将参与生物大分子的氧化并引起机体的氧化损伤。若及时补充外源性抗氧化剂,可加速体内自由基的清除、抑制机体的氧化损伤。目前已有报道证实麦胚多肽在体内外具有一定的抗氧化能力,但研究多局限于体外发光法检测或传统的动物实验方面,缺乏抗氧化肽对氧化损伤保护机制的深入研究。因此,本论文拟采用H202作为诱导剂,人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y为载体,探讨麦胚抗氧化肽的神经保护作用及其作用机理。论文首先对近年来已分离鉴定出的麦胚抗氧化肽进行制备和筛选,结果表明麦胚抗氧化肽RVF对细胞氧化损伤保护效果最好,故选取作为进一步的研究对象。为深入了解麦胚抗氧化肽RVF的抗氧化机理,本实验利用H202建立了SH-SY5Y细胞氧化损伤模型,从细胞存活率、乳酸脱氢酶（1actate dehydrogenase,LDH）释放率、细胞形态学观察RVF对H202诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用,结果表明RVF预孵育后可将细胞存活率提高18.02%、LDH释放率降低20.00%、细胞形态也得到显著改善。通过比色法检测了细胞内总抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）的含量,结果显示麦胚抗氧化肽RVF预处理后细胞内总抗氧化能力提高了27.33%、MDA含量也显著下降。通过流式细胞术检测了细胞内氧自由基（reactive oxygen species, ROS）生成、线粒体膜电位以及Ca2+稳态的变化,结果表明RVF预处理后能够有效抑制ROS的生成与聚集、恢复线粒体跨膜电位及维持Ca2+稳态。采用Hoechst 33342和PI核染色法检测了细胞的凋亡率和形态变化,结果显示RVF预孵育后能改善细胞的凋亡形态,抑制凋亡小体的形成,细胞凋亡率下降10.81%；采用采用蛋白质印记（western blot）检测了SH-SY5Y细胞内相关凋亡蛋白Bcl-2、 Bax、PARP、caspase-3的表达量,结果发现RVF预孵育后能够显著促进Bcl-2的表达、抑制Bax的表达；Bcl-2/Bax的比值虽然在低浓度变化不大,但在中高浓度时提高了18.67%和24.97%；RVF还进一步抑伟caspase-3的激活及其对底物PARP的切割。实验结果表明麦胚抗氧化肽RVF可通过抑制H202诱导的神经细胞凋亡发挥保护作用。本研究结果表明麦胚抗氧化肽RVF对H202诱导神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用,其保护机制包括提高细胞内的总抗氧化能力、抑制脂质过氧化反应和细胞内ROS生成、维持线粒体跨膜电位和Ca2+稳态、增加抗凋亡蛋白的表达并阻止线粒体通路的激活等,因此,可将麦胚抗氧化肽作为食品或医药领域潜在的抗氧化剂进行开发。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 自由基概述
• 1.1.1 自由基的产生
• 1.1.2 自由基对机体的危害
• 1.1.3 自由基与神经退行性疾病
• 1.2 氧化应激与抗氧化保护
• 1.3 麦胚蛋白与抗氧化肽的研究现状
• 1.3.1 麦胚与麦胚蛋白
• 1.3.2 麦胚生物活性肽及其抗氧化功能研究进展
• 1.4 课题立项依据与研究内容
• 1.4.1 立项背景及意义
• 1.4.2 课题研究内容
• 第二章 麦胚抗氧化肽对细胞氧化损伤的保护作用
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 主要仪器与设备
• 2.2 实验细胞株
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 麦胚抗氧化肽的合成
• 2.3.2 细胞培养相关试剂的配制
• 2.3.3 细胞复苏、培养与传代、冻存
• 2.3.4 细胞存活率检测
• 2O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型的建立'>2.3.5 H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型的建立
• 2O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用'>2.3.6 麦胚抗氧化肽对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用
• 2.3.7 LDH释放率检测
• 2.4 数据统计与分析
• 2.5 结果与讨论
• 2O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型的建立'>2.5.1 H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型的建立
• 2.5.2 麦胚抗氧化肽的筛选
• 2.5.3 RVF对SH-SY5Y细胞活性的影响
• 2O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用'>2.5.4 RVF对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用
• 2.6 本章小结
• 第三章 麦胚抗氧化肽RVF对氧化应激致细胞抗氧化水平及钙稳态的影响
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 实验细胞株
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞培养与分组
• 3.3.2 细胞总抗氧化能力的测定
• 3.3.3 细胞内丙二醛含量的测定
• 3.3.4 细胞内活性氧含量的测定
• 2+浓度的测定'>3.3.5 细胞内Ca²⁺浓度的测定
• 3.3.6 数据统计与分析
• 3.4 结果与讨论
• 2O₂诱导氧化损伤的SH-SY5Y细胞总抗氧化能力的影响'>3.4.1 RVF对H₂O₂诱导氧化损伤的SH-SY5Y细胞总抗氧化能力的影响
• 2O₂诱导氧化损伤的SH-SY5Y细胞内MDA含量的影响'>3.4.2 RVF对H₂O₂诱导氧化损伤的SH-SY5Y细胞内MDA含量的影响
• 2O₂诱导氧化损伤的SH-SY5Y细胞内ROS的增高'>3.4.3 RVF抑制H₂O₂诱导氧化损伤的SH-SY5Y细胞内ROS的增高
• 2O₂诱导氧化损伤的SH-SY5Y细胞内钙离子浓度的增高'>3.4.4 RVF抑制H₂O₂诱导氧化损伤的SH-SY5Y细胞内钙离子浓度的增高
• 3.5 本章小结
• 2O₂诱导细胞凋亡的保护作用'>第四章 麦胚抗氧化肽RVF对H₂O₂诱导细胞凋亡的保护作用
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 主要仪器与设备
• 4.2 实验细胞株
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 细胞培养与分组
• 4.3.2 麦胚抗氧化肽对细胞凋亡的影响
• 4.3.2.1 细胞调亡形态学变化
• 4.3.2.2 细胞亚二倍体检测凋亡率
• 4.3.3 线粒体跨膜电位的测定
• 2O₂诱导SH-SY5Y细胞凋亡相关信号蛋白的影响'>4.3.4 麦胚抗氧化肽对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞凋亡相关信号蛋白的影响
• 4.3.5 蛋白浓度测定
• 4.3.6 数据统计与分析
• 4.4 结果与讨论
• 2O₂诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡'>4.4.1 麦胚抗氧化肽RVF抑制H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡
• 2O₂诱导的细胞凋亡'>4.4.2 麦胚抗氧化肽RVF通过线粒体途径抑制H₂O₂诱导的细胞凋亡
• 4.5 本章小结
• 主要结论
• 创新点与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录A
• 附录B